BALB/c小鼠免疫重组相思子毒素B链蛋白的免疫应答①

王俊虹 武 佳 魏茂提

(武警后勤学院部队流行病学和统计教研室，天津 300309)

BALB/c小鼠免疫重组相思子毒素B链蛋白的免疫应答①

王俊虹②武 佳 魏茂提②

(武警后勤学院部队流行病学和统计教研室，天津 300309)

目的评价重组相思子毒素B链蛋白(rATB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫效果，并初步探讨其免疫机制。方法以rATB为免疫原，腹腔免疫雌性BALB/c小鼠，间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a，流式细胞技术检测IFN-γ、IL-4，并进行天然毒素攻毒实验和体外中和实验。结果血清IgG、IgG1效价达到1∶106以上，且攻毒后产生二次免疫应答，与PBS对照组差别有统计学意义(P<0.05)；而IgG2a的血清效价未发生明显变化。细胞因子检测结果表明IFN-γ的表达量与PBS组差异无统计学意义，而IL-4的表达量显著提高(P<0.05)。小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明，腹腔注射rATB可以抵抗最高剂量为5×LD50的天然AT毒素中毒，保护率为100%。结论rATB蛋白免疫小鼠后显示出良好的免疫原性，能诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，为候选疫苗的研制奠定基础。

相思子毒素；B链；免疫应答；生物恐怖

相思子毒素(Abrin toxin，AT)来源于植物相思子(Abrus precatorius)的种子，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)[1]。AT分子量约为65 kD，由A、B两条多肽链(ATA和ATB)组成。由于AT具有毒性强、来源广、易于制备等特点，被认为是重要的致死性生物恐怖剂，因此相关的疫苗研制成为各国的研究热点[2,3]。

本研究旨在利用已制备的重组蛋白rATB(E.coliM15/pQE80L-ATB诱导表达)[4]，腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠，观察其免疫后机体全身的或局部的免疫效果并分析其免疫应答机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1重组蛋白和天然毒素 重组蛋白rATB(E.coli M15/pQE80L-ATB表达、纯化获得)、天然AT均为本课题组制备[4]。

1.1.2主要试剂和仪器 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a；ELISA用显色液均购自北京天根生物公司；液相内毒素清除剂购自北京天恩泽基因科技有限公司；其他化学试剂为国产分析纯；Coulter Epics XL型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.1.3实验动物 BALB/c小鼠(雌性，6～8周龄，体重约18～20 g)：购于军事医学科学院实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK-(军)2015-005。

1.2方法

1.2.1免疫接种

1.2.1.1实验动物分组 20只6～8周龄雌性BALB/c小鼠分为4组，每组5只。实验组攻毒剂量分别为2×、5×、6×LD50，对照组注射PBS，攻毒剂量为2×LD50。

1.2.1.2免疫方案 PBS稀释的rATB溶液(25 μl/只，100 μl)腹腔注射，免疫周期为0-14-28-42 d[5]。

1.2.2血清IgG、IgG1、IgG2a的检测 每次免疫1周、攻毒后1周尾静脉取血，室温留取血清备用。定量后的rATB蛋白5 μg/ml，100 μl/孔，包被酶标板，间接ELISA法[5]检测血清抗体效价和抗体分型(HRP标记羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a，1∶5 000稀释)。

1.2.3细胞因子检测

1.2.3.1重组蛋白去除内毒素 按说明书操作。

1.2.3.2脾淋巴细胞培养 在四免后1周，随机选取免疫小鼠5只，颈椎脱臼处死后无菌取脾脏，剪碎、研磨挤压成单细胞悬液后，离心、弃掉上清，溶红细胞30 s后PBS洗2次，吹打均匀，以台盼蓝拒染法进行活细胞计数，要求活细胞数在90%以上；加1 ml 1640细胞培养基(10% FBS)重悬，调整细胞至1×107个/ml。

1.2.3.3IFN-γ、IL-4检测 24孔板中加入细胞(2～4)×107个/孔；rATB蛋白(经优化10 μg/ml)；CD28：1 μg/ml；CD49d：1 μg/ml；GolgiStop：1 μg/ml。经1640细胞培养基(10% FBS)至1.5 ml终体积。经优化作用12 h后，1 500 r/min离心5 min后弃上清收集细胞，加入工作浓度的BD固定/透膜液250 μl 重悬，4℃避光20 min；1 500 r/min离心5 min后弃上清，150 μl PBS重悬细胞，分为3管分别加入不同组合的单克隆抗体(CD3e-FITC、CD4-PECY5、CD8-APC、IFNγ-PE、IL-4-PE、Rat IgG1-PE)，避光4℃反应30 min。各管加入1 ml PBS重悬，1 500 r/min 离心5 min后弃上清，重复2次；加入4%多聚甲醛150 μl，避光4℃保存，1周内用流式细胞仪分析。

1.2.4小鼠攻毒保护试验 四免1周后进行小鼠攻毒保护试验，即分别注入含2×LD50、5×LD50、6×LD50剂量的天然AT。此外，5只小鼠组成PBS免疫组，注入含2×LD50天然毒素。每天观察小鼠体重变化和死亡情况，共10 d。

1.2.5体外中和实验[5]取rATB免疫小鼠和PBS组小鼠血清备用，并重新选取雌性BALB/c小鼠20只，分为4组，每组5只，分别与2×LD50、5×LD50、6×LD50剂量的天然AT混合，对照组为PBS组小鼠血清与2×LD50的天然毒素混合。将纯化的天然AT配制成10 μg/ml(LD50=2.58 μg/kg)，实施体外中和试验。

1.3统计学分析 数据经SPSS17.0和Graphpad软件进行统计。抗体效价经几何均数数据变换后经方差分析。计量资料采用成组t检验和秩和检验；计数资料采用一般χ2检验和Fisher精确检验进行统计分析。

2 结果

2.1IgG和抗体亚型分析 图1显示：rATB四免后小鼠血清IgG效价达到1∶107，攻毒后产生了二次免疫应答；IgG1的效价可达到1∶106，而IgG2a的血清效价最高只可达1∶102。PBS组血清IgG、IgG1、IgG2a则无明显变化。

2.2细胞因子检测 采用2×2析因设计方差分析，结果如表1所示，细胞因子IFN-γ：蛋白刺激剂量(10 μg/ml和20 μg/ml)和作用时间(12 h和24 h)差异无统计学意义(P>0.05)；IL-4：刺激剂量和作用时间差异有统计学意义(P<0.05)，即10 μg/ml的蛋白刺激剂量，作用时间为12 h时表达量最高；同型对照IgG1，蛋白刺激剂量和作用时间差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见，根据rATB体外刺激免疫小鼠脾脏细胞因子检测的刺激条件为蛋白刺激剂量为10 μg/ml、作用时间为12 h。

图1 不同时期血清中抗体效价水平Fig.1 Antibody titers of sera after each immunization and challenge trial

GroupsIFN-γ12h24hIL-412h24hIgG112h24h10μg/ml2.07±0.411.54±0.4515.77±3.0612.86±2.172.44±0.521.98±0.3320μg/ml2.11±0.561.94±0.299.56±3.086.67±1.862.05±0.582.56±0.72

图2 rATB免疫小鼠脾脏细胞因子水平Fig.2 Levels of cytokine of rATB in spleen after immunity

图3 体内攻毒实验小鼠存活情况和体重变化Fig.3 Vaccination with rATB followed by different doses of AT administered by i.p.injectionNote: A.Average weights (as percentage of initial weight)；B.Survival curves.

此外，图2显示在rATB在最佳刺激条件下，与同型对照IgG1组比较，细胞因子IFN-γ表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而IL-4的表达量有显著性提高(P<0.05)。

2.3小鼠攻毒保护实验 AT在2×LD50，5×LD50攻毒剂量下，小鼠均存活且体重在10 d内逐渐恢复正常；6×LD50剂量攻毒的小鼠死亡2只，即生存率仅为60%。PBS组免疫小鼠在2×LD50剂量攻毒后全部死亡(图3)。

图4 体外中和实验变化图Fig.4 rATB neutralization assay and efficacy of passive protectionNote: A.Average weights (as percentage of initial weight)；B.Survival curves.

2.4小鼠体外中和实验 如图4所示：2×LD50和5×LD50剂量组小鼠全部存活，而6×LD50剂量组小鼠死亡3只，生存率仅为40%。PBS组小鼠全部死亡。

3 讨论

作为重要的致死性生物毒素战剂，AT的毒性是普通化学武器的几百倍[3,6]，易被恐怖分子利用，因此发展有效的防治手段，即研发预防性疫苗，用于应对生物恐怖已成为各国生防领域的重要任务。

目前关于AT相关的生防疫苗研制较少，主要包括类毒素和基于A链亚单位。其中，经甲醛化处理后的全毒素[3]、ATA突变体(mABRAE164-AR167L)[2]和ATA的截断片段[6]，均能抵抗致死剂量的天然毒素攻毒，显示出良好的免疫原性，但由于具有毒性而限制了进一步的使用。毒素B链亚单位疫苗的研究较少，主要因为B链的免疫原性一直存有争议。文献报道B链的免疫原性不如A链[7,8]，但也研究表明B链同样是良好的疫苗候选抗原[9,10]，尤其是作为结合链，B链对人体无毒性，使得其作为疫苗候选成为可能。本研究采用E.coli M15/pQE80L-ATB表达、纯化获得的rATB为免疫原腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠，评价其免疫效果[4，5]，并初步探讨其免疫机制。图1结果显示，经过四免后，rATB免疫小鼠血清IgG的效价达107以上，攻毒后产生二次免疫应答，PBS组小鼠血清IgG未发生明显变化(P<0.05)，IgG1的结果变化相同，而IgG2a与PBS组小鼠血清差异无统计学意义(P>0.05)。同时，细胞因子的检测结果显示：与同型对照IgG1组比较，IFN-γ表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而IL-4的表达量有显著性提高(P<0.05)。抗体亚型分析和细胞因子(IFN-γ和IL-4)检测结果提示，重组蛋白rATB免疫小鼠后能诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，但不能诱导IgG2a和Th1优势应答。此外，经小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明，rATB可以完全抵抗5×LD50剂量的天然AT攻毒。

总之，本研究对大肠杆菌表达系统中获得的重组蛋白rATB进行了免疫效果评价并初步分析了免疫机制，结果表明免疫小鼠可诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，并保护致死剂量的AT攻毒，为研究相思子B链疫苗奠定了基础。

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ImmuneresponseofarecombinantabrinBchainproteinagainstabrinintoxicationinBALB/cmice

WANGJun-Hong,WUJia,WEIMao-Ti.

LogisticsUniversityofPAP，MilitaryEpidemiology&StatisticsSection,Tianjin300309,China

Objective:To evaluate the immune response efficiency of the recombinant abrin B chain protein (rATB) in BALB/c mice.MethodsBALB/c mice were vaccinated intraperitoneally (i.p.) with the purified rATB protein.ELISA was used to detect the IgG,IgG1and IgG2a.Meanwhile,the expression of IL-4 and IFN-γ were detected by flow cytometry.Then the protein neutralization assay and efficacy of passive protection were done.ResultsThe anti-rATB antibody was detected by ELISA after vaccinated the rATB in the mice and results showed that the highest titer reached 106,which was acquired after the last vaccination.Meanwhile,a strong secondary response was triggered in mice when challenged with toxin.In contrast,the antibody response of the PBS-vaccinated mice was less than 1∶10 andP<0.05 indicated obvious difference between test group and control group.The result of IgG1was the same as the IgG,while the result of IgG2ahad not changed.There was significant difference for IL-4 between two groups (P<0.05),while no significant difference for IFN-γ was observed.All BALB/c mice survived after challenged with 5×LD50of AT.Transfusion of sera from immunized mice provided passive protection in naive mice.Furthermore,the rATB could induce specific neutralizing antibodies against abrin toxin.ConclusionThe recombinant protein can induce the Th2-type immune response and trigger a good immune response and protective efficacy,which means it may be a promising vaccine candidate against human exposure to AT.

Abrin toxin;B chain;Immune response;Bioterrorism

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.014

R392

A

1000-484X(2017)12-1824-04

①本文受武警后勤学院博士启动金项目(WHKF201503)和军事预防医学“2110”三期工程建设项目资助。

②同时供职于天津市职业与环境危害防治重点实验室，天津 300309。

王俊虹(1977年-)，女，博士，讲师，主要从事生物战剂的侦检与防治方面的研究，E-mail：wangjunhong11007@163.com。

[收稿2016-10-21 修回2016-11-21]

(编辑 张晓舟)