α-突触核蛋白通过上调内吞蛋白Rab5B促进海马神经元膜表面NMDA受体内在化

陈 敏 于文娇 李 昕,4,5 杨巍巍,4,5 李旭冉 于 顺,4,5*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室 北京市老年病医疗研究中心，北京 100053；2.桂林医学院附属医院神经科学实验室，广西桂林 541001；3.首都医科大学帕金森病临床诊疗与研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重点实验室和教育部神经变性病重点实验室，北京 100053；5.国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100053)

·Alpha-突触核蛋白的致病机制·

α-突触核蛋白通过上调内吞蛋白Rab5B促进海马神经元膜表面NMDA受体内在化

陈 敏1,2于文娇1,3李 昕1,3,4,5杨巍巍1,3,4,5李旭冉1,3于 顺1,3,4,5*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室 北京市老年病医疗研究中心，北京 100053；2.桂林医学院附属医院神经科学实验室，广西桂林 541001；3.首都医科大学帕金森病临床诊疗与研究中心，北京 100053；4.帕金森病北京市重点实验室和教育部神经变性病重点实验室，北京 100053；5.国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100053)

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)对N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptors，NMDA)受体的调控及机制。方法在原代海马神经元，通过细胞外添加基因重组α-Syn和基因过表达α-Syn方法实现细胞内α-Syn含量增高，基因敲减技术抑制Rab5B，Western blotting法分析NMDA 受体NR1亚单位和Rab5B表达。结果神经元内α-Syn含量增高可以使Rab5B表达上调，并降低膜表面NR1的水平；抑制Rab5B表达可有效反转α-Syn所致的膜表面NR1水平下降。结论α-Syn通过上调Rab5B促进NMDA受体的内在化。

α-突触核蛋白；NMDA受体；内在化；Rab5B；海马神经元

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是由140个氨基酸构成的小分子蛋白质，在正常情况下主要以可溶性的单体形式存在于神经元[1]。然而，α-Syn的代谢发生障碍，使其在神经细胞内异常积聚，进而聚集成纤维而以包涵体的形式沉积在神经细胞内[2]，形成突触核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)及多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)的标志性病理改变。研究[3-6]表明，异常表达的α-Syn参与突触核蛋白病所共有的海马相关记忆功能异常及认知功能下降，而记忆与认知障碍被认为与海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体功能异常密切相关[7-8]。但是，α-Syn在病理情况下的异常高表达是否影响海马神经元NMDA受体的表达进而导致认知下降尚未明确。

研究[9]表明，分泌到细胞外的α-Syn可以被一种被称为Rab的GTP酶介导快速摄入细胞，且Rab5B被证明通过网格蛋白(clathrin)介导的内吞机制促进NMDA受体的内在化[10]。因此，本研究将利用大鼠海马原代神经元，通过基因过表达及敲减技术，研究α-Syn对NMDA受体的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康出生12 h内新生Wistar大鼠(30只，分为6组，n=5)，购自中国人民解放军军事医学科学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK-2014-004。杜恩斯组织匀浆器(Wheaton Kimble公司，美国)。Neurobasal A培养基、B27、L-谷氨酰胺、DMEM培养基(Gibco公司，美国)；胎牛血清(Berlin公司，美国)；NMDA、MK-801(Sigma公司，美国)；Rab5B反义寡核苷酸(百恩维公司，中国)；NMDAR NR1抗体、Calnexin抗体、β-tubulin抗体(Abcam公司，美国)；Rab5B抗体(Santa Cruz公司，美国)；BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Biotech公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 重组人源α-Syn制备与纯化

将人源α-Syn cDNA分别插入表达载体pET(3a)，然后转化至BL21(DE3)感受态细胞，在含氨苄西林的2%(质量分数)YTA 培养液中培养，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达后，采用离子交换层析和反向层析法纯化。纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE法和蛋白免疫印迹(Western blotting)法鉴定，BCA法测定蛋白浓度。部分纯化α-Syn委托公司标记绿色荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)。

1.2.2 海马原代神经元培养

将出生12 h内新生Wistar大鼠分离得到的海马组织置于预冷解剖液中，剪碎加入0.25%(质量分数)胰酶消化40 min后终止消化；抛光滴管轻轻吹打成单细胞悬液；用200目尼龙网过滤后按2×105个/cm2的密度接种至多聚-L-赖氨酸预处理35 mm培养皿或75 cm2塑料培养瓶中。置于37 ℃，含5%(体积分数) CO2的培养箱中培养，待神经元贴壁后改用Neurobasal A培养，后每隔3 d换半液。海马原代神经元培养至9 d时，向培养基中加入表达绿色荧光蛋白的慢病毒(lentivirus-green fluorescent protein,LV-GFP)或过表达α-Syn的慢病毒(LV-GFP-α-Syn)，继续培养72 h；海马原代神经元培养至12 d时，分别向培养基中加入过滤除菌的PBS、溶菌酶(lysozyme)、纯化的α-Syn或FITC-α-Syn(终浓度为10 μmol/L)，孵育24 h。

1.2.3 Rab5B反义寡核苷酸的制备

Rab5B反义寡核苷酸(antisense sequence，AS)及扰乱顺序的寡核苷酸(scramble sequence，SS)其序列分别是：5′-GCTGTGCTTCTGCTAGTCATTTCAAGAGA ATGACTAGCAGAAGCACAGCTTTTTTCTCGAGG-3′和5′-GATCCCTCGAGAAAAAAGCTGTGCTTCTGCTAGT CATTCTCTTGAAATGACTAGCAGAAGCACAGC-3′。

1.2.4 细胞总蛋白及膜蛋白提取

向收集好的细胞里加入全细胞裂解液(或细胞膜裂解液)，充分悬浮细胞沉淀，冰上静置裂解30 min，离心30 min(4 ℃，12 000 g)，上清即全细胞蛋白(或膜蛋白)，BCA法测定蛋白浓度。

1.2.5 Western blotting分析

采用7.5%(质量分数)SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，经半干法将蛋白质转印至PVDF膜；PVDF膜与NMDAR NR1抗体(1∶1 000)、α-Syn抗体(3D5,1∶5 000)、Rab5B抗体(1∶1 000)、抗GFP单克隆抗体 (1∶1 000)、calnexin抗体(1：1 000)或抗β-tubulin抗体(1∶5 000)，4 ℃反应过夜，后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)室温反应1 h，ECL试剂盒检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 α-Syn下调海马神经元细胞膜NMDARNR1浓度

Western blotting分析结果显示，各组细胞总蛋白中的NMDAR NR1水平无差异；在PBS、对照蛋白Lysozyme及LV-GFP处理组，细胞膜上NMDAR NR1亚基水平较高；而用外加α-Syn和FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn转染处理的神经元，细胞膜组分内的NR1水平显著下降(n=5,P<0.05)(图1)。

2.2 α-Syn通过上调Rab5B促进海马神经元细胞膜NMDARNR1内在化

Western blotting结果显示，与对照组相比，α-Syn处理细胞(外加人重组α-Syn组、FITC-α-Syn及LV-GFP-α-Syn)中的Rab5B蛋白表达水平增高显著(n=5,P<0.05)(图2)。利用Rab5 siRNA抑制Rab5B表达后，Rab5B表达水平下降，同时α-Syn所致的膜表面NR1降低效应被反转(图3)。

图2 α-Syn上调Rab5B蛋白的表达Fig.2 α-Syn up-regulates the expression of Rab5B protein

图3 抑制Rab5B蛋白表达可反转α-Syn降低的神经元膜表面NR1的效应Fig.3 Inhibition of Rab5B expression reverses the effect of α-Syn on internalization of surface NR1

2 讨论

本研究利用原代培养大鼠海马神经元研究了α-Syn对海马神经元膜表面NMDARs的影响。除了通过基因转染方法实现细胞内α-Syn过表达外，笔者还利用α-Syn可以迅速通过细胞膜的特性，通过细胞外添加α-Syn造成细胞内α-Syn含量的增加。这种方法已在本课题组以往的研究中[11]得到论证。本研究发现，无论在α-Syn基因转染神经元还是细胞外添加α-Syn处理的神经元，膜表面NR1的水平都发生明显的下调，而细胞总NR1不变，由此推测，NR1发生了内在化。鉴于NR1是构成功能性NMDARs的必须亚单位[8]，其在膜表面的减少意味着功能性NMDARs的减少。已知，Rab5B是一种调节内吞机制的蛋白质，以往在多巴胺神经细胞证明该蛋白参与了α-Syn对NMDA受体内在化的调控[12]。因此，在本研究进一步观察了Rab5B在α-Syn调节海马神经元内在化过程中的作用。结果显示，海马神经元细胞内α-Syn含量增加伴随Rab5B表达的增加，而抑制Rab5B的表达则显著缓解过α-Syn所致的细胞膜表面NR1下调。这些结果提示Rab5B参与了α-Syn对海马神经神经元膜表面NMDA受体内在化的调控。

NMDA受体丰富表达于海马神经元，通过介导海马神经元长时程增强电位形成而参与学习和记忆活动，该受体在海马神经元膜表面减少将影响动物的学习和记忆功能[8]。研究[13-14]显示，在阿尔茨海默病、PD和DLB患者以及模型动物的海马神经元膜表面的NMDA受体的密度降低，且这一改变与认知功能下降具有相关性。本研究探究了突触核蛋白病的关键致病蛋白α-Syn与NMDA受体内在化的相关机制，对揭示PD及DLB等与α-Syn相关的神经退行性疾病的认知功能障碍的机制提供了线索。

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α-SynucleinpromotesNMDAreceptorinternalizationbyupregulationofendocytosisproteinRab5B

Chen Min1,2,Yu Wenjiao1,3,Li Xin1,3,4,5,Yang Weiwei1,3,4,5,Li Xuran1,3,Yu Shun1,3,4,5*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofGeriatrics,Beijing100053,China;2.LaboratoryofNeuroscience,AffliliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,GuangxiZhuangAutomousRegion,China;3.ClinicalCenterforParkinson’sDisease,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;4.BeijingKeyLaboratoryforParkinson’sDiseaseandKeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseases,MinistryofEducation,Beijing100053,China;5.NationalClinicalResearchCenterforGeriatricDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveTo investigate the effect of α-synuclein (α-Syn) on surface N-methyl-D-aspartic acid receptors (NMDARs) in cultured rat hippocampal neurons.MethodsIncreased intracellular α-Syn was realized by extracellular addition of recombinant human α-Syn to the culture medium or transfection of human α-Syn gene to the neurons.Western blotting analysis was applied to observe the effects of α-Syn on levels of NMDA receptor NR1 subunit and Rab5B under conditions with or without Rab5B knockdown.ResultsIntracellular elevation of α-Syn decreased the surface expression of NMDA NR1 and cytoplasmic levels of Rab5B;Inhibition of Rab5B expression reversed the effects of α-Syn.ConclusionThe accumulation of α-Syn in hippocampal neurons can promote the internalization of surface NMDARs through an endocytic mechanism that requires participation of Rab5B.

α-synuclein;NMDA receptor;internalization;Rab5B;hippocampal neurons

国家自然科学基金(81371200,81071014,81401042)，北京市医院管理局“使命”计划专项经费资助(SML20150803)，北京市科学技术委员会资助(Z161100005116011，Z171100000117013)，北京市卫生和计划生育委员会项目(PXM2017_026283_000002)，广西自然科学基金(2014GXNSFAA118197)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81371200,81071014,81401042),Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Mission Plan (SML20150803),Beijing Municipal Science &Technology Commission (Z161100005116011，Z171100000117013),Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (PXM2017_026283_000002),Natural Science Foundation of Guangxi (2014GXNSFAA118197).

*Corresponding author，E-mail：yushun103@163.com

时间：2017-12-13 20∶53

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2053.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.017]

Q 189

2017-10-23)

编辑 慕 萌