枸杞多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用及机制研究*

许 拓，凌宏艳+，龙 佳，何剑琴，杨丝丝，朱责梅，颜灿群Δ，奉水东

枸杞多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用及机制研究*

许 拓1，凌宏艳1+，龙 佳2，何剑琴1，杨丝丝1，朱责梅1，颜灿群2Δ，奉水东3Δ

（1.南华大学生理学教研室，2.附属第二医院内分泌科，3.社会医学与卫生事业管理学教研室，湖南衡阳421001）

目的：观察不同浓度的枸杞多糖（LBP）对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响并探讨其机制。方法：采用高糖高胰岛素处理HepG2细胞24 h建立胰岛素抵抗细胞模型后，用台盼蓝检测活力大于95%的HepG2细胞，以104／孔密度接种于 96孔板内，细胞贴壁后以 30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml的 LBP培养 48 h，200μl／well，各组均设 4个复孔。检测不同浓度的LBP对HepG2细胞活性及胰岛素抵抗的影响；细胞内丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；各组细胞胰岛素信号转导通路中相关蛋白（IRS-2、PI3-K、Akt、GLUT2）的表达。结果：MTT显示：与正常对照组相比，IR模型组MDA含量显著升高，SOD活力明显降低，同时IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显下降；与IR模型组相比，中、高浓度LBP组MDA的含量明显降低，SOD的活力显著升高，且IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显升高；在相同的时间内，随着LBP浓度的增加，OD值逐渐降低；在同一浓度干预下，随着时间的延长，OD值也逐渐降低；葡萄糖消耗实验表明中、高浓度的LBP可显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量，而低浓度LBP对HepG2细胞葡萄糖消耗量无明显影响。结论：中、高浓度枸杞多糖能改善HepG2细胞胰岛素抵抗，其作用机制可能与降低细胞氧化应激水平及提高胰岛素信号传导通路相关蛋白表达有关。

枸杞多糖；HepG2细胞；胰岛素抵抗；氧化应激；胰岛素信号通路

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的重要发病机制之一，伴随T2DM发生发展的整个过程［1-2］，另外IR是肥胖、高血压、动脉粥样硬化等代谢相关疾病的共同病理生理基础［3］。因此，寻找改善IR药物日益被人们所重视。

枸杞多糖（lyceum barbarum polysaccharide，LBP）是从枸杞中提取出来的具有多种生物活性的大分子物质，是枸杞发挥各种作用的主要成分之一［4］。研究显示：LBP能提高链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平［5-7］；LBP可以改善HepG2细胞的胰岛素抵抗；LBP也能降低2型糖尿病患者血糖、升高胰岛素水平［8］。这些研究提示：LBP在降血糖、改善胰岛素抵抗、抗氧化应激等方面均有较好的效果，但目前尚无对其分子机制的研究。为此，本研究观察不同浓度的LBP对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HepG2细胞由湖南省南华大学附属第二医院临床研究所馈赠，枸杞多糖购自上海江莱生物科技有限公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，血清购于美国Hyclone公司，MTT粉购于美国Sigma。SOD和MDA测试盒购于南京建成生物研究所；兔抗GLUT2多克隆抗体购于美国stant，兔抗PI3-K多克隆抗体购于美国CST，兔抗Akt多克隆抗体购于美国proteintech，兔抗IRS2多克隆抗体购于Abcam。

1.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

将处于对数生长期的HepG2细胞用胰蛋白酶消化后，1 000 r／min离心5 min收集细胞，加新鲜培养液吹打细胞成单细胞悬液，调整细胞密度为106cells／ml，均匀接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，更换为含高糖高胰岛素的DMEM培养基培养24 h，通过葡萄糖消耗实验判断胰岛素抵抗细胞模型的建立。

1.3 MTT比色法

用台盼蓝检测活力大于95%的HepG2细胞，以104／孔密度接种于96孔板内，细胞贴壁后加入0、100、300、500、1 000、3 000、5 000μg／ml 7个浓度的LBP，每孔200μl，各组均设 4个复孔。培养 24、48、72 h后，每孔加入 5 mg／ml MTT 20μl，37℃，5%CO2继续孵育4 h，将每孔里面的上清小心吸弃，然后加入二甲基亚砜，每孔加入150μl，混匀后用 Bio-Tek酶标仪分析在490 nm处的吸光度（OD）值，取均值并绘制生长曲线。

1.4 葡萄糖消耗实验

实验细胞分5组：正常对照组（C）、IR模型组、300μg／ml高浓度 LBP组（H-LBP）、100μg／ml中浓度LBP组（M-LBP）、30μg／ml低浓度 LBP组（L-LBP）。将96孔板中的HepG2细胞弃去旧培养基，换上含高糖高胰岛素的DMEM培养基培养24 h。药物干预组分别给予200μl／well相应浓度的药物处理48 h。上述各组再分别用含和不含胰岛素的培养基进行培养。24 h后葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD法）测定每孔细胞的培养基中葡萄糖的含量，通过与未接种细胞的空白孔的葡萄糖含量均值相减，计算每孔细胞葡萄糖的消耗量。

1.5 MDA含量、SOD活力的测定

按照试剂盒说明书顺序加入反应液，比色法测定MDA含量和SOD活力。

1.6 Western blot检测各组 IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白的表达

提取各组细胞蛋白进行蛋白定量后，取蛋白样品30μg进行电泳，转膜、封闭、加入抗 IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2抗体孵育，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析

1.7 统计学处理

各组实验数据计量资料用均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS19.0统计分析软件进行分析，多组间比较用ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 枸杞多糖对HepG2细胞增殖的影响

在相同的时间内，随着LBP浓度的增加，OD值逐渐降低；在同一干预浓度下，随着时间的延长，OD值也逐渐降低，呈时间-量效关系。但同一浓度在24 h和48 h的OD值间没有明显差异，而72 h与24 h、48 h相比，OD值明显降低（p＜0.05）。从曲线可以看出，当浓度为0～300μg／ml的 LBP作用HepG2细胞48 h，对细胞活力无显著性影响，当LBP浓度超过300μg／ml，细胞 OD值明显下降（p＜0.05，图 1）。因此，为了排除LBP对细胞活力的影响，本实验选择 30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml枸杞多糖处理细胞48 h。

2.2 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

HepG2细胞用高糖高胰岛素培养24 h后，其葡萄糖消耗量较正常组降低45.9%，表明高糖高胰岛素可诱导HepG2细胞胰岛素抵抗。与IR模型组相比，无胰岛素刺激时，H-LBP、M-LBP、L-LBP组葡萄糖消耗量皆显著升高；有胰岛素抵抗刺激时，HLBP、M-LBP组葡萄糖消耗显著升高，L-LBP组葡萄糖消耗量无显著性差异（图2）。

Fig.1 Effects of different concentration and time of LBP on cells proliferation compared with 72 h group（¯x±s，n＝3）*p＜0.05 vs 24 h group；＃p＜0.05 vs 48 h group

Fig.2 Effects of different concentration LBPon glucose consumption of insulin resistant HepG2 cells（¯x±s，n＝6）C：Control：IR：Insulin resistance；LBP：Lyceum barbarum polysaccharide*p＜0.05 vs contorl；＃p＜0.05 vs IR group；Δp＜0.05 vs non-insulin group

2.3 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞MDA含量和SOD活力的影响

与正常对照组相比，IR模型组细胞MDA含量升高61%，SOD活力降低29.9%；与 IR模型组相比，H-LBP、M-LBP组MDA含量显著降低，而SOD活力显著升高（p＜0.05，表 1）。

Tab.1 Effects of different concentration of LBPon the content of MDA and the activity of SOD of insulin resistant HepG2 cells（¯x±s，n＝6）

2.4 枸杞多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞 IRS-2、Akt、PI-3K、和 GLUT2蛋白表达的影响

Western blot结果显示：与正常对照组相比，IR模型组细胞IRS-2、Akt、PI-3K、和GLUT2蛋白表达水平显著降低（p＜0.05）；与 IR模型组相比，H-LBP组、M-LBP组细胞 IRS-2、Akt、PI-3K、和 GLUT2蛋白表达水平显著升高（p＜0.05，图 3），L-LBP组轻微升高，差异不具有统计学意义。

Fig.3 Effects of LBP on protein expression of IRS-2，Akt，PI-3K，and GLUT2 in insulin resistant HepG2 cells（¯x±s，n＝5）IR：Insulin resistance；LBP：Lyceumbarbarum polysaccharide*p＜0.05 vs contorl group；＃p＜0.05 vs IR group

3 讨论

随着人们的生活方式发生改变，全球糖尿病尤其是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐渐上升，目前全球约3.5亿糖尿病患者，预计到2050年将会有5.52亿［9］。胰岛素抵抗是 T2DM的始发因素，是T2DM的重要发病基础，逐渐成为糖尿病医学研究的重点［10］。早期干预IR的发生或许可以有效防治2型糖尿病，成为2型糖尿病治疗的新方向。IR的形成主要是由于胰岛素信号转导通路受阻，或者通路中关键蛋白作用减弱而使胰岛素不能发挥其正常的生理作用［11，12］，是胰岛素抵抗发生的重要机制，通路中无论哪一个信号分子结构或功能的异常均可导致胰岛素抵抗。随着对IR的进一步研究，发现氧化应激水平的升高与胰岛素抵抗的发生密切相关［13，14］。枸杞多糖在抗氧化应激、降血糖、改善胰岛素抵抗方面均有较好的作用，但其具体机制尚无报道。HepG2细胞来源于肝细胞，是一种与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，保留了肝细胞许多生物学特性［15］，故本实验通过采用高糖高胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型，采用MTT检测不同浓度LBP处理HepG2细胞24 h、48 h、72 h。48 h与24 h处理组在300μg／ml LBP作用下细胞活力无显著差异，故选择48 h。观察不同浓度LBP处理对胰岛素抵抗HepG2细胞SOD活力、MDA含量及IRS-PI3K-Akt胰岛素信号通路相关蛋白表达的影响。结果显示：在胰岛素刺激时，各组的葡萄糖消耗量较无胰岛素时显著升高，说明LBP可以促进胰岛素介导的葡萄糖消耗。H-LBP、M-LBP组MDA含量显著降低，SOD活力显著升高，表明LBP通过升高胰岛素抵抗HepG2细胞SOD的活力，降低MDA的含量提高细胞的抗氧化、清除氧自由基的能力而改善细胞胰岛素抵抗。H-LBP、M-LBP的 IRS-PI3KAkt胰岛素信号通路相关蛋白表达水平显著升高，表明LBP能通过增加胰岛素信号通路中的相关蛋白水平从而改善HepG2细胞的胰岛素抵抗。

综上所述：枸杞多糖能改善HepG2细胞胰岛素抵抗，其作用机制可能与降低细胞氧化应激水平及提高胰岛素信号传导通路中 IRS2、PI3K、Akt、GLUT2的蛋白表达有关。

［1］ 李 斌，范 源，李 鑫.基于PI3K／Akt信号通路的中药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗研究进展［J］.中成药，2017（1）：151-154.

［2］ 钟丽媛.2型糖尿病胰岛素抵抗研究进展［J］.继续医学教育，2016，30（8）：150-152.

［3］ Wilcox G.Insulin and insulin resistance［J］.Clin Biochem Rev，2005，26（2）：19-39.

［4］ 加杨娥，任立汆，燕华玲.枸杞多糖对糖尿病患者的疗效研究进展［J］.世界最新医学信息文摘，2016，16（52）：54-55.

［5］ 杨荣敏.枸杞多糖降血糖作用的细胞实验探究［J］.世界最新医学信息文摘，2016，16（51）：325-326.

［6］ 王 玲，郑开俊，董德勇，等.氧化应激在实验性糖尿病神经病变中的作用［J］.中国应用生理学杂志，2008，24（1）：108-111.

［7］ 郭 健，徐国兴，王婷婷，等.枸杞多糖对糖尿病大鼠视网膜神经细胞氧化损伤的保护作用［J］.中国临床药理学杂志，2015，31（24）：2448-2450.

［8］ Cai HZ，Liu FK，Zuo PG，et al.Practical application of antidiabetic efficacy of lycium barbarum polysaccharide in patients with type 2 diabetes［J］.Med Chem，2015，11（4）：383-390.

［9］ Whiting DR，Guariguata L，Weil C，et al.IDF diabetes atlas：global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030［J］.Diabetes Res Clin Pract，2011，94（3）：311-321.

［10］周方圆，杨宇峰，石 岩.2型糖尿病胰岛素与胰岛素抵抗信号转导通路研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2016，18（11）：71-73.

［11］Chakraborty C.Biochemical and moleacular basis of insulin resistance［J］.Curr Protein Pept Sci，2006，7（2）：13-21.

［12］Chi M，Ye Y，Zhang XD，et al.Insulin induces drug resistance in melanoma through activation of the PI3K／Akt pathway［J］.Drug Des Devel Ther，2014，2（8）：255-262.

［13］潘慧敏，姜保平，乐 亮，等.藤茶主要成分对胰岛素抵抗HepG2细胞内氧化应激水平的影响［J］.中国现代中药，2015，17（3）：267-271.

［14］王燕萍，潘晓东，姜苏原，等.氧化应激可通过NF-κB-iNOS-NO信号通路诱导小鼠胰岛β细胞凋亡［J］.中国应用生理学杂志，2009，25（2）：255-259.

［15］韦乃球，冼寒梅，杨 柯，等.白子菜对HepG2细胞胰岛素抵抗改善作用的实验研究［J］.时珍国医国药，2011，22（6）：1395-1396.

Ameliorative effects and the mechanism of lyceum barbarum polysaccharide on insulin resistance of Hep G2 cell

XU Tuo1，LING Hong-yan1+，LONGJia2，HE Jian-qin1，YANG Si-si1，ZHU Ze-mei1，YAN Can-qun2Δ，FENG Shui-dong3Δ
（1.Department of Physiology，2.The Second Hospital of University of South China，3.Department of Social Medicine and Health Service Management，University of South China，Hengyang 421001，China）

Objective：To observe the effects of lyceum barbarum polysaccharide（LBP）on insulin resistance of HepG2 cells and investigate its possible mechanism.Methods：IR-HepG2 cell model was induced with high glucose and high insulin in combination for 24 hours，with 104／vaccination in the96-well plates，hole density after adherent cells（30μg／ml、100μg／ml、300μg／ml）LBPcultivate48 h，200μl／hole，each all had four holes.The effects of LBPat different concentrations on HepG2 cell activity and insulin resistance were tested.Intracellular malondialdehyde（MDA）content and superoxide dismutase（SOD）activity were detected.The expressions of related proteins in insulin signal transduction pathways such as insulin receptor substrate-2（IRS-2），phosphatidylinositol-3-kinase（PI3-K），protein kinase B（Akt）and glucose transport-2（GLUT2）were determined.Results：Compared with normal control group，the content of MDA was increased significantly and the activity of SOD and the expression levels of IRS-2，PI-3K，Akt and GLUT2 were decreased significantly in the IRmodel group.Compared with IR model group，medium and high concentrations of LBPdecreased the content of MDA and increased the activity of SOD and the expression levels of IRS-2，PI-3K，Akt and GLUT2 in insulin-resistant HepG2 cells.MTT showed that at the same time，the OD value gradually decreased with the increase of LBP’s concentration；under the same concentration of LBP，the OD value also gradually decreased with the extension of time，which indicated that LBPinhibited the proliferation of HepG2 cells with time and concentration-dependent manner.Glucose consumption experiment indicated that medium and high concentration of LBP could increase the glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells significantly，but low concentration of LBPhad no significant impacted on glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells.Conclusion：Medium and high concentration of LBPcan improve insulin resistance of HepG2 cell，its mechanisns may be associated with decreasing the level of oxidative stress and increasing the protein expressions of insulin signaling pathway.

lyceum barbarum polysaccharide； HepG2 cell； insulin resistance； oxidative stress； insulin signaling pathway

R587.2；R742

A

1000-6834（2017）06-568-04

10.12047／j.cjap.5524.2017.134

教育部留学归国基金（教外司留［2014］1685号）；湖南教育厅（16C1411）；衡阳市科技局（2016KJ64）

2016-11-21

2017-06-29

△【通讯作者】Tel：86-0734-8281621；E-mail：shuidong f＠hotmail.com；+：并列第一作者