阿魏酸对糖尿病大鼠肾脏足细胞nephrin、podocin蛋白表达的影响*

王旭焘，潘定一，郭 玮，陈思思，周 斌，杨钧杰，齐敏友

阿魏酸对糖尿病大鼠肾脏足细胞nephrin、podocin蛋白表达的影响*

王旭焘，潘定一，郭 玮，陈思思，周 斌，杨钧杰，齐敏友△

（浙江工业大学药学院药理学教研室，杭州310014）

目的：研究阿魏酸（FA）对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠肾脏足细胞损伤的影响，并探讨其可能的机制。方法：雄性 SD大鼠尾静脉一次性注射 STZ（40 mg／kg，i.v.），72 h后将血糖高于 16.7 mmol／L者视为糖尿病造模成功，将其随机分为模型组、阿魏酸组，每组10只；另取10只雄性 SD大鼠作为对照组；阿魏酸组（100 mg／kg，i.g.，qd），从大鼠血糖升高第5周开始给药，连续8周。测定空腹血糖、体重 、肾脏脏器系数、血清尿素氮、肌酐含量；HE染色观察肾组织病理变化；免疫组化测定肾组织nephrin、podocin蛋白表达。结果：与对照组比较，模型组肾脏脏器系数增大，肾功能下降；病理学显示肾脏细胞萎缩，排列不整齐，并伴有间质增生；足细胞nephrin、podocin蛋白表达明显减少，阿魏酸组明显改善上述指标。结论：阿魏酸具有改善STZ致糖尿病大鼠肾脏功能的作用，其机制可能与上调肾脏足细胞nephrin、podocin蛋白表达有关。

阿魏酸；糖尿病肾病；大鼠；足细胞；nephrin；podocin

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，临床特点表现为进行性蛋白尿［1］。足细胞结构和功能损伤是引起DN蛋白尿的重要原因［2］。足细胞裂孔隔膜的特征蛋白nephrin、podocin，维持着足细胞的正常形态和功能，其异常表达与 DN的发生发展密切相关［3］。阿魏酸，广泛存在于阿魏、当归、川芎等中药材，现代药理学研究表明，阿魏酸具有镇静、保护心肌损伤、抗血小板聚集、抗炎等功效［4-5］。Choi［6］等研究发现，阿魏酸通过减轻氧化应激和炎症反应对糖尿病大鼠肾脏起保护作用，但阿魏酸对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤是否具有保护作用，未见报道。本实验通过STZ致糖尿病大鼠肾病模型，研究阿魏酸对糖尿病大鼠肾脏足细胞的保护作用并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体重（190±10）g，浙江医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 药物与试剂

链脲佐菌素，美国Sigma公司；阿魏酸，西安小草植物科技有限公司；血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量、考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程有限公司；兔抗大鼠podocin、兔抗大鼠nephrin，博士德生物技术有限公司。

1.3 仪器

AL204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；高速冷冻离心机（德国Thermo公司）；HM325E型轮转式石蜡切片机（德国Microm公司）；血糖测试仪及试纸（美国Johnson公司）。

1.4 模型建立和药物处理

雄性SD大鼠，分笼饲养。隔夜禁食，尾静脉一次性注射 STZ（40 mg／kg，STZ用 pH4.5、1 mol／L柠檬酸缓冲液溶解）。72 h后尾静脉取血测定血糖水平，高于16.7 mmol／L者视为糖尿病造模成功，将其随机分为模型组、阿魏酸组，每组10只。另取10只雄性SD大鼠作为对照组，对照组大鼠尾静脉一次性注射相应体积柠檬酸钠缓冲溶液。给药开始于造模成功后第 5周，阿魏酸组（100 mg／kg，i.g.，qd）以0.5%羧甲基纤维素钠为溶媒，制成混悬液；对照组和模型组按体重给予相应体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液；连续8周。

1.5 生化指标测定

空腹12 h后，尾静脉取血，测定血糖。大鼠眼眶取血，静置；3 500 r／min，4℃，离心，10 min；取血清测定肌酐、尿素氮（按试剂盒说明书操作）。处死大鼠并迅速摘取肾脏，去除周围脂肪及结缔组织，生理盐水洗净后滤纸吸干，称取肾脏质量，按末次体重计算肾脏脏器系数（肾脏脏器系数＝肾脏重／体重）。取右侧肾脏于生理盐水冰浴条件下制成10%匀浆液；3 500 r／min，4℃，离心 10 min；取上清-20℃保存，用于蛋白含量测定。

1.6 组织学测定

取左侧肾脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（4μm），HE染色后，置光镜下观察病理变化。

1.7 免疫组化检测

Envision法检测 nephrin、podocin蛋白在肾脏的分布及表达，DAB显色15 min，流水冲洗，苏木素复染。选取切片置于400倍光镜下，取10个视野点，采用Image-pro plus 5.0软件分析，测定吸光度均值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 阿魏酸对糖尿病大鼠一般体征、血糖及肾脏脏器系数影响

与对照组相比，模型组大鼠精神状态较差，毛发光泽度低、散乱枯黄，反应迟钝，伴有多食、多饮、多尿症状，消瘦体、重减轻；血糖明显升高（p＜0.01）、肾脏脏器系数明显增大（p＜0.01）。阿魏酸组大鼠一般体征较对照组相近，三多一少症状减轻，血糖水平较模型组有所下降，但无统计学差异（P＞0.05）；脏器系数减小（p＜0.05，表1），提示阿魏酸对糖尿病大鼠肾脏肥大具有改善作用。

Tab.1 Changes of blood glucose，body weight and kidney organ coefficient（¯x±s，n＝10）

2.2 阿魏酸对糖尿病大鼠肾功能BUN和Cr影响

与对照组相比，模型组大鼠BUN、Cr水平均明显升高（p＜0.01），阿魏酸组 BUN、Cr水平较模型组均有下降（p＜0.05，表2）。提示阿魏酸能改善糖尿病大鼠肾功能。

2.3 HE染色法观察肾脏组织病理形态变化

HE染色显示：对照组肾小球结构饱满，体积正常，肾小管排列整齐，未出现肾小管-间质损伤。模型组肾脏细胞萎缩，肾小球结构紊乱，发生空泡样变化，系膜增生情况明显，肾小管排列杂乱，肾小管-间质损伤明显。阿魏酸组：较模型组肾脏细胞萎缩减轻，肾小球结构清晰，系膜增生情况减轻；肾小管排序正常；无明显肾小管-间质损伤（图1）。

Tab.2 Comparison of serum levels of BUN and Cr（¯x±s，n＝10）

Fig.1 The pathological structure changes of rats（HE×200）A：Control group；B：Model group；C：FA group；FA：Fumalic acid

2.4 肾脏组织免疫组化学染色情况

免疫组化结果显示，对照组肾小球周围有较多nephrin和podocin蛋白阳性棕黄色颗粒；模型组肾小球周围仅有微量棕黄色阳性颗粒，与对照组比较有统计学差异（p＜0.01）；阿魏酸组 nephrin和 podocin蛋白阳性着色增加（p＜0.01，图 2、图 3）。

Fig.2 Expressions of nephrin in renal tissues of rats（Immunohistochemical staining×400）A：Control group；B：Model group；C：FA group；FA：Fumalic acid**p＜0.01 vs A；＃＃p＜0.01 vs B

Fig.3 Expressions of podocin in renal tissues of rats（Immunohistochemical staining×400）A：Control group；B：Model group；C：FA group；FA：Fumalic acid**p＜0.01 vs A；＃＃p＜0.01 vs B

3 讨论

本实验以STZ诱导建立糖尿病肾病大鼠模型，大鼠空腹血糖升高，肾功能下降，HE染色显示肾组织结构受损，表明造模成功。经阿魏酸干预后，足细胞特征蛋白nephrin、podocin表达上调，肾组织受损程度减轻，肾功能明显改善，说明阿魏酸对肾脏具有保护作用。

肾小球滤过屏障由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞构成。足细胞足突之间交叉形成裂孔，其上覆盖的隔膜中表达多种特征蛋白。研究表明，DN早期即出现足细胞结构和功能损伤，足细胞特征蛋白的缺失，致使裂孔间隙增大，肾小球滤过屏障遭到破坏，蛋白随原尿漏出。Nephrin是一种特异性表达于裂孔隔膜上的膜蛋白，Doublier［7］等研究发现，糖尿病患者肾小球足细胞nephrin表达显著减少；Podocin是另一种特异性表达于裂孔隔膜的膜蛋白，Baelde［8］等研究发现 DN患者足细胞 podocin蛋白表达亦显著降低。我们在实验中发现，与对照组相比，DN大鼠肾组织中nephrin、podocin蛋白表达均明显下降，这与文献报道相一致。

阿魏酸在治疗 DN方面取得一些进展：Prabhakar［9］等报道，阿魏酸联用降血糖药二甲双胍能明显改善糖尿病大鼠肾功能。Ramar［10］等报道，阿魏酸通过抑制促炎因子NF-κβ表达，减轻大鼠由糖尿病引起的肾脏炎性损伤。本实验我们发现，阿魏酸亦能通过上调足细胞nephrin、podocin蛋白表达，减轻糖尿病大鼠足细胞损伤。

综上所述，DN导致足细胞特征蛋白 nephrin、podocin表达减少，加剧DN的发生发展。阿魏酸能减轻足细胞损伤，改善肾功能，保护肾脏，从而延缓DN的进程，其机制可能与阿魏酸上调足细胞podocin、nephrin蛋白表达有关。由于临床上尚缺乏针对DN有效的治疗手段，因此，阐明阿魏酸对肾脏保护作用的机制，对开发中药治疗临床DN具有重要的理论意义和实用价值。

［1］ Dei Cas A，Gnudi L.VEGF and angiopoietins in diabetic glomerulopathy： how far for a new treatment［J］.Metabolism，2012，61（12）：1666-1673.

［2］ 曹延萍，王 莎，刘 杰，等.线粒体凋亡途径在高糖刺激的小鼠足细胞凋亡中的作用［J］.中国应用生理学杂志，2013，29（3）：244-246.

［3］ Patrakka J，Tryggvason K.Nephrin--a unique structural and signaling protein of the kidney filter［J］.Trends Mol Med，2007，13（9）：396-403.

［4］ Roy S，Metya SK，Sannigrahi S，et al.Treatment with ferulic acid to rats with streptozotocin-induced diabetes：effects on oxidative stress，pro-inflammatory cytokines，and apoptosis in the pancreaticβcell［J］.Endocrine，2013，44（2）：369-379.

［5］ 连加辨，吴枝娟，方秋娟，等.阿魏酸钠对幼大鼠心肌柔红霉素损伤的保护作用［J］.中国应用生理学杂志，2015，31（1）：54-58.

［6］ Choi R，Kim BH，Naowaboot J，et al.Effects of ferulic acid on diabetic nephropathy in a rat model of type2 diabetes［J］.Exp Mol Med，2011，43（12）：676-683.

［7］ Doublier S，Salvidio G，Lupia E，et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy：evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin II［J］.Diabetes，2003，52（4）：1023-1030.

［8］ Baelde HJ，Eikmans M，Lappin DW，et al.Reduction of VEGF-A and CTGF expression in diabetic nephropathy is associated with podocyte loss［J］.Kidney Int，2007，71（7）：637-645.

［9］ Prabhakar PK，Prasad R，Ali S，et al.Synergistic interaction of ferulic acid with commercial hypoglycemic drugs in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Phytomedicine，2013，20（6）：488-494.

［10］Ramar M，Manikandan B，Raman T，et al.Protective effect of ferulic acid and resveratrol against alloxan-induced diabetes in mice［J］.Eur J Pharmacol，2012，690（1-3）：226-235.

Effects of ferulic acid on the expressions of nephrin and podocin in podocytes of diabetic rats

WANG Xu-tao，PAN Ding-yi，GUO Wei，CHEN Si-si，ZHOU Bin，YANG Jun-jie，QI Min-you△
（Department of Pharmacology，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Objective：To investigate the effects of ferulic acid（FA）on the streptozocin（STZ）-induced kidney injury in diabetic rats and its possible mechanisms.Methods：Diabetes was induced in male SD rats by an injection of STZ（40 mg／kg，i.v.）.After 72 hours，blood glucose levels were detected and blood glucose levels exceeded 16.7 mmol／L were diagnosed as diabetic model rats.Diabetic model rats were randomly divided into model group and FA group，ten animal in each group.Another 10 healthy male SD rats were treated as control group.The rats in FA group were treated with FA（100 mg／kg，i.g.，qd）from the5th week since the diabetic rats model was successfully established and lasted for 8 weeks.The levels of blood glucose，body weight，organ coefficient of kidney，blood urea nitrogen and creatinine were tested.HEstaining was employed to observe the pathological changes of the renal tissue.Immunohistochemistry was employed to determine the protein of nephrin and podocin.Results：Compared to control group，the levels of blood glucose，organ coefficient of kidney，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（sCr）were increased significantly.Renal cells from model group rats showed atrophied and disordered after HE staining and interstitial proliferation were also appeared in renal tissue of the model group.Meantime，the levels of nephrin and podocin protein were obviously decreased.These changes were significantly attenuated in the model group treated with FA.Conclusion：FA can evidently ameliorate renal damage in rats with diabetic nephropathy induced by STZ，which might be related to increase the level of nephrin and podocin protein.

ferulic acid； diabetic nephropathy； rat； podocytes； nephrin； podocin

R587.1

A

1000-6834（2017）06-564-04

10.12047／j.cjap.5475.2017.133

浙江省自然科学基金（LY16H280013）；浙江省科技厅新苗人才计划（2015R403050）；浙江工业大学大学生创新创业训练计划（2017094）

2016-07-18

2017-05-18

△【通讯作者】Tel：0571-88320535；E-mail：qiminyou＠163.com