新生儿百日咳诊断及病原菌耐药性分析

曾 珠

西安市儿童医院急诊科(西安710003)

·临床检验·

新生儿百日咳诊断及病原菌耐药性分析

曾 珠

西安市儿童医院急诊科(西安710003)

目的：探讨新生儿百日咳的诊断方法，分析病原菌的药物敏感性，为患儿后期治疗提供可靠依据。方法：采集76例疑似患儿鼻咽拭子，分别使用细菌培养和PCR检测法进行确诊，随后采用琼脂稀释最低抑菌浓度法(MIC)、E-test法和纸片扩散法检测分离菌株对红霉素、头孢唑啉等抗菌药物的敏感性。结果：细菌培养法获得5株百日咳杆菌菌株，阳性率为6.58%；PCR检测阳性率达到27.63(21例)%，两种检测方法在阳性检出率方面的差异具有统计学意义(P<0.05)。5株百日咳杆菌红霉素纸片扩散法的抑菌圈直径皆>42 mm(47～55 mm)，E-test MIC为0.051～0.089 μg/ml，琼脂稀释法MIC均为0.135 μg/ml；头孢唑啉MIC均为0.03 μg/ml，头孢替安MIC为 0.015～0.025 μg/ml、阿奇霉素MIC为 0.030～0.060 μg/ml、环丙沙星均为2 μg/ml、克林霉素为1～2 μg/ml。结论： PCR在新生儿百日咳检测中检出效率高，红霉素可作为治疗新生儿百日咳的良好药物。

百日咳是一种好发于婴幼儿期的由G-鲍特菌属短杆菌引发的重要传染性呼吸道疾病。目前，针对百日咳的诊断国外实验室主要采用PCR技术，因而我国主要采用细菌培养及血清学检测等实验室检测方法[1]。本研究就百日咳疑似患儿诊断方法及感染性病原菌耐药性做了详细研究，报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选择2015年4月至2016年4月期间就诊的疑似患儿76例，其中男39例，女37例；患儿发病日龄14～28(21.66±3.73)d。纳入标准：存在阵发性咳嗽，且持续2周以上者；咳嗽过程中出现呕吐，甚至舌系带发生溃疡或结膜下出血者。排除标准：存在严重肝肾功能异常者；不愿参与研究者。所有患儿家属均自愿签署知情协议书。

2 方 法

2.1 病原菌分离检测：采集患儿鼻咽拭子后即刻接种到选择性木炭琼脂培养基中，37℃孵育，3 d后开始观察菌落变化，培养7～14 d。待发现圆形的灰白色、半透明状疑似菌落即可进行下一步实验进行鉴定。鉴定试验依据《全国临床检验操作规程》中的格兰染色、触酶试验及百日咳杆菌的血清凝集实验过程进行操作[2]。百日咳杆菌菌落判断：显微镜检测结果显示G-的短小球杆菌，触酶试验显示(+)，且百日咳杆菌血清凝集试验结果(+)，而副百日咳杆菌结果为(-)。

2.2 PCR检测：将取得的患儿鼻咽拭子样本置入1 ml无菌生理盐水中洗涤，所得浸液于15000 r/min转速下离心20 min，弃上清，用Omega公司提供的DNA提取试剂盒提取样本DNA[3]。依据参考文献[4]：上游引物选择5'-TGAGAAACTGGAAATCGCCAACCCC-3' ，下游引物选择5'-CGCTTGCGGCGCAGCTCCACGATAG-3'；选择百日咳实验室检测插入序列IS481为靶基因；扩增DNA片段为308个碱基对。PCR反应体系：5 ul10×Buffer缓冲液；0.2 mmol/L的dNTP；0.4 mmol/L的上下引物；2.5U的Taq DNA聚合酶；2 ulDNA模板，总体积25 ul。基因组DNA扩增条件： 94 ℃下变性50 s； 58 ℃下退火 30 s； 72 ℃下延伸 30 s，共30 个循环。最后72 ℃延伸10 min。经PCR扩增所得样本DNA 产物需经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离(Marker 作参照)，当凝胶中的目标条带处出现特异性条则为(+)。

2.3 病原菌药物敏感性检测:选择琼脂稀释MIC法检验分离到的百日咳杆菌的耐药性。本研究所选择抗生素有红霉素、头孢唑啉、头孢替安、阿奇霉素、克林霉素、左氧氟沙星。其中红霉素除采用上述方法外，还使用纸片扩散法和E-test法进行检验。培养皿，90 mm；培养基，25 ml 含10%脱纤维羊血的碳琼脂培养基。E-test纸条购于法国AB BIOMERIEUX公司；质控菌选择金黄色葡萄球菌ATCC 25923、流感嗜血杆菌ATCC49247。在检测菌株孵育72h读取抑菌圈直径及MIC指。

3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。计数资料采用[例(%)]表示，行χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 经细菌分离培养鉴定 结果显示76份新生儿的鼻咽拭子中百日咳杆菌培养阳性者5例，总阳性率仅6.58%；PCR检测结果显示，76份样本中阳性者为21例，阳性率达到27.63%。百日咳细菌培养和PCR检测的阳性率之间对比，差异具有统计学意义(χ2=4.87，P<0.05)。

2 分离菌株药物敏感性检测 结果对细菌分离培养法鉴定得到的5株菌株进行抗生素敏感性试验，见表1。细菌培养得到的5株百日咳杆菌的红霉素纸片扩散实验结果中抑菌圈直径皆大于42 mm(47～55 mm)；红霉素E-test MIC结果在0.051～0.089 μg/ml，其中编号为201601的菌株红霉素E-test MIC最小；琼脂稀释法中红霉素MIC都为0.135 μg/ml，头孢唑啉MIC都为0.03 μg/ml，头孢替安MIC范围为0.015～0.025 μg/ml、阿奇霉素MIC范围为0.030～0.060 Mμg/ml、环丙沙星均为2 μg/ml、克林霉素范围为1～2 μg/ml。

表1 5株百日咳杆菌抗菌药物敏感性检验结果

讨 论

百日咳在我国属于乙类传染性疾病，免疫接种措施使该疾病发病率保持在1/10万以下，然近年来该病发病率出现反弹，甚至局部出现暴增现象，例如西安市2014年发病率与上一年相比增加了238%，甚至未央区、灞桥区等区域发病率均超过1/10万[4]。新生儿对于百日咳杆菌的免疫性抗体主要来源于母体，或后天的免疫接种。75%的新生儿出生时其体内的百日咳杆菌抗体低于保护性水平水平，超过90%的新生儿在出生后因体内抗体流失，因而在6周后易受病原菌侵染，造成新生儿百日咳发病率增加。

百日咳杆菌的细菌培养法、血清学及分子生物学检测等是当前临床中常用的百日咳诊断方法。从卡他或痉咳初期患儿的鼻咽拭子中获得百日咳杆菌是百日咳诊断的金标准，该方法虽特异性较好，但结果需等3～7d的培养后方能知晓，且取样前抗生素使用、病程及疫苗接种情况均对检测的敏感性产生很大影响。病原菌的核酸扩增技术大大提高了百日咳确诊率，检测敏感性在90%以上，特异性高于95%。黄海涛研究发现，百日咳患儿PCR阳性检出率为50.76%，更适合于早期病程患儿病情诊断[5]。本研究对76例疑似百日咳患儿采用鼻咽拭子的细菌培养法和PCR检测法进行确诊，结果表明，PCR检测法阳性检出率明显高于对照组。

王增国[6]对抗红霉素的百日咳杆菌菌株的耐药机制进行研究发现，百日咳杆菌耐药性主要是A2047G 突变引起的。以往研究发现，红霉素是可用于任何年龄段儿童的抗菌药物，安全、低毒，此外其具有很强的细胞穿透力，可维持炎性反应病灶区的局部高浓度，且可直接调节机体免疫功能紊乱[7]。具体为：通过提高细胞内cAMP水平，促进中性粒细胞及巨噬细胞等细胞凋亡，加速Ca2+内流，从而抑制组胺等致敏物质的释放；同时可显著抑制COX-2蛋白及白细胞粘附分子Mac-1的表达。鉴于红霉素高效的抗菌作用及免疫调节功能，本院将其作为治疗百日咳的首选药物，该结论与罗洁等研究一致。

[1] 闫 莉, 黄 英, 叶泽慧. 百日咳与百日咳综合征的诊治分析[J]. 重庆医科大学学报, 2016, 41(4):355-359.

[2] 尚 红, 王毓三, 申子瑜.全国临床检验操作规程(第4版)[M]. 人民卫生出版社,2014:568-773.

[3] 刘永梅, 刘 芳, 曹 明. 手足口病171例病原学与临床特点分析[J]. 陕西医学杂志, 2016, 45(3):347-347.

[4] 韩锐郡, 刘 莹, 栾 阳,等. 西安市2014年百日咳的流行病学及其实验检测结果分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26(1):54-56.

[5] 黄海涛, 刘 勇, 高志刚,等. 不同病程百日咳病例各种实验室检测方法的对比研究[J]. 中国疫苗和免疫, 2014,20(4):330-334.

[6] 王增国, 刘 莹, 韩锐郡,等. 百日咳鲍特菌红霉素耐药性及耐药相关分子特征分析[J]. 中国疫苗和免疫, 2016, 22(2):180-182.

[7] 王建忠, 李学超. 静脉注射乳糖酸红霉素联合人免疫球蛋白治疗婴幼儿重症毛细支气管炎临床分析[J]. 河北医药, 2014, 36(7):1038-1040.

百日咳/诊断 新生儿 @病原菌耐药性

R725.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.073

(收稿：2017-06-15)