草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用

高 岩，裴 超，张 超，李 筝，孔祥会

( 河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用

高 岩，裴 超，张 超，李 筝，孔祥会

( 河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

草鱼呼肠孤病毒；疫苗研发；免疫预防

随着水产养殖产业的不断扩大，我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年，水产养殖产量以每年5%～6%稳步增长，在2013年，中国水产养殖产量达4.542×107t，占全球水产养殖总产量的60%以上[1]。根据世界粮农组织数据显示，2015年我国水产养殖总量达7.430×107t。这些数据表明我国水产养殖业不仅保障了中国水产品的市场供应，也对世界水产品供给做出了重大贡献[2]。我国水产养殖以淡水鱼类为主，其中草鱼(Ctenopharyngodonidellus)养殖是淡水养殖中重要的组成部分，也是国内养殖量最大的鱼类[3]。草鱼由于饲料来源广，生长速度快，经济价值高，养殖范围规模大，广受养殖人员的喜爱，但草鱼抗病能力差，各个阶段都易受到病害感染，常见疾病有草鱼肠炎病、赤皮病、烂鳃病和病毒性出血病，其中草鱼病毒性出血病是危害最严重的病害，流行地区广泛、发病率高、死亡率高，严重威胁着草鱼养殖业[4-5]。早在20世纪50年代，我国就开始对草鱼出血病进行研究，在70年代末分离确定病原为病毒颗粒，至1991年国际病毒分类委员会将其命名为草鱼呼肠孤病毒(AquareovirusC type Grass carp reovirus)[6]。国内许多学者对草鱼呼肠孤病毒的研究集中在病毒的生物学特性[7-8]、感染机制[9]、与草鱼免疫系统的相互作用[10]，取得了许多成果，为抗病毒疫苗和药物的研发提供基础资料。目前该病发生后没有非常有效的治疗药物，而运用疫苗和免疫药物来提高草鱼抗呼肠孤病毒的免疫能力是当前防治疾病的主要措施。笔者着重总结了近年来关于草鱼呼肠孤病毒疫苗的制备方法、给药方式及其优缺点的比较等内容，以期为草鱼呼肠孤病毒病的免疫防治提供参考。

1 草鱼呼肠孤病毒研究

1.1 病原

草鱼呼肠孤病毒，是我国分离到的第一株鱼类病毒，隶属水生呼肠孤病毒属。其形态结构为20面体对称的球形颗粒，直径为70～80 nm，具双衣壳，无囊膜[11]。方勤等[12]对草鱼呼肠孤病毒及衣壳蛋白的纯化和低温电镜观察确定病毒颗粒呈多层排列，包括RNA核心与内壳层、中间层及外壳层，同时衣壳蛋白电泳显示，病毒颗粒含有7种蛋白(VP1～VP7)组分。其基因组由双链RNA组成，现在已经确认的基因组有11个片段，命名为S1～S11，编码11或12种蛋白[13-14]。根据-vp6-基因序列比较，草鱼呼肠孤病毒分离株至少存在3种基因型，代表株分别为Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒经典株(873株)、Ⅱ型浙江湖州分离株(HZ08株)和Ⅲ型湖北分离株(104株)[15]。常见毒株基因与编码蛋白对应见表1。草鱼呼肠孤病毒在pH 3～10 的范围内活性稳定，HZ08的适应范围较其他毒株广，3种类型毒株对乙醚和胰蛋白酶处理均不敏感，反复冻融对病毒活性影响较大，不同细胞系对不同毒株的敏感性不同[16]。

表1 常见毒株基因及其编码蛋白

注：HZ08为浙江湖州分离株，GD108株为广东分离株，GCReV-109株为湖北分离株.

1.2 病毒感染及致病机制

根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则和已知研究，草鱼呼肠孤病毒结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS80、NS31、NS38等的功能已经初步明确[17-22]，进而可推测病毒粒子的感染机制。草鱼呼肠孤病毒进入细胞分为侵入、增殖、装配和释放4个步骤。第一步，病毒进入细胞阶段主要靠VP5和VP7等外衣壳蛋白发挥识别和穿膜作用协助病毒进入细胞；第二步，病毒核酸和蛋白质合成阶段，病毒核酸在VP2作用下合成mRNA，双层衣壳中的VP1形成跨内外衣壳蛋白层的通道，便于mRNA转移；第三步，在病毒粒子组装过程中NS80和NS38共同形成包涵体的基本结构，VP3是内层核衣壳骨架蛋白，能绑定dsRNA。NS80通过结合VP3在包涵体内富集病毒内层蛋白和病毒基因组，首先组装病毒内层核衣壳，之后外衣壳蛋白再进入包涵体进行外层衣壳的组装。VP6用于连接内层蛋白层与外层蛋白层，和VP4蛋白共同在病毒复制过程中起辅助作用；第四步，NS31蛋白具有膜渗透性和引起膜融合的功能，将病毒渗透到细胞外继而引起细胞融合[23-26]。

草鱼呼肠孤病毒主要感染2龄以下的鱼种，健康草鱼从感染到发病需要4～15 d，死亡率超过80%。在临床上会表现以下症状：初期草鱼会有食欲不振、头部发黑、停止摄食、离群缓游等症状，随着病情加重草鱼会出现不同部位的出血症状，可见部位有头部、鳃盖、上下颌、腹部及尾部等，据此可分为红肌肉型、红鳍红鳃盖型和肠炎型3种[27]。病理组织观察血管内皮细胞受损，血管壁通透性增高引起毛细血管或小血管出血，使循环血量减少，同时形成血於或血栓破坏了局部的血循环，使正常代谢发生障碍，进而导致脏器组织病变[28]。

2 草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发

草鱼出血病严重危害渔业养殖的经济利益，一旦感染此病，未及时发现治疗，即可能导致全池鱼死亡，造成不可估量的损失，所以应积极采取行之有效的措施进行防治。药物防治和免疫预防是鱼病防治的主要方法。由于鱼体本身的生活环境导致患病个体及时发现难、治疗难，而且当前没有研发出该病毒的特效药物，滥用药物则导致药物残留，产生耐药性或危害人类食用安全，因此应该科学的使用鱼类疫苗提高鱼体免疫力进行免疫防病。

草鱼出血病疫苗的研究始于20世纪60年代的组织匀浆灭活疫苗，由于组织匀浆疫苗免疫效果不稳定，之后通过病毒的细胞培养并灭活后制备灭活疫苗，病毒传代培养获取弱毒毒株，以制备减毒活疫苗，均取得了较好效果，在渔业生产中推广使用，具有良好的经济和社会效益。随着现代分子生物学和基因工程技术的发展，渔用疫苗的研究热点转向亚单位疫苗以及基因工程疫苗等。

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗是指利用化学或物理方法使病原失去致病力而保留抗原的免疫原性的一类疫苗。草鱼呼肠孤病毒目前发现有3种基因型，免疫原性有一定差别，针对不同的病原选择合适的灭活方式，同时也可以添加佐剂增强疫苗的稳定性和免疫效力，确保疫苗高效稳定。我国最早使用的“土疫苗”就是组织匀浆灭活疫苗，操作简单，广泛应用于疾病防控，但是常由于灭活不完全，导致病原毒力未完全失去，从而免疫效果不稳定，引起健康鱼感染。 至20 世纪80年代初，杨先乐等[29-33]进行了草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究，克服了“土疫苗”的缺点。针对毒株854、836-w制备疫苗，对其灭活条件、最佳免疫剂量、佐剂使用、稳定性等方面进行了评价，并进行了中试试验及大规模的实际运用，结果表明，细胞灭活疫苗免疫保护率高(约85%)，在4～5 d引起鱼体产生免疫力，保护力可持续到60 d以上，疫苗性能稳定、安全可靠、免疫保护力高, 保护时效长，同时大规模生产工艺使疫苗推广应用产生不错的经济效益和社会效益。近年来，一些学者从基因水平对灭活疫苗注射后产生的非特异性免疫和特异性免疫应答进行研究，为该疫苗的推广提供理论依据。Yi等[34]探究了草鱼出血病灭活疫苗对草鱼脾脏中免疫球蛋白M、主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅰ型干扰素、补体3、白细胞介素1β、内凝集素相关基因表达的影响，发现内凝集素、主要组织相容性复合体Ⅰ、白细胞介素1β、补体3基因的相对表达量随时间变化先上调后下调，Ⅰ型干扰素相对表达量在6 h后达到峰值，之后降至正常水平，免疫球蛋白M相对表达量在72 h内持续上调。灭活疫苗诱导草鱼的特异性免疫应答中可能增强了机体呈递抗原的能力，同时激活了补体系统。

2.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是病原体经过物理或化学方法处理后毒性亚单位结构改变，毒力减弱或消失，仍保留很好的免疫原性，可以正常繁殖感染机体的疫苗。减毒活疫苗较灭活疫苗有以下优点，由于毒性减弱不能引起疾病，通过自然感染途径接种，可以诱导出黏膜免疫，使机体获得广泛的免疫保护。同时病毒可以自我复制增殖、水平传播，诱导鱼体及整个群体产生较强的免疫效果。但是减毒活疫苗可能出现毒力返祖，存在致病风险。1986年以来，许淑英等[35-36]对草鱼出血病弱毒疫苗进行研制和免疫效果观察，并在此基础上对弱毒疫苗的最小免疫量，免疫产生期，免疫保护(持久)期和保存期进行了测定，并发现桉液是良好的减毒剂。从20世纪90年代开始对研制的草鱼出血病冻干细胞弱毒疫苗进行近二十年的中试和推广，直至2011年初农业部批准草鱼出血病活疫苗的生产使用[农业部公告1525号]，国内外首个草鱼出血病活疫苗成功问世[37]。传统方法筛选减毒疫苗，遗传背景不清楚，可能存在不确定的威胁。目前基因重组技术发展成熟，运用基因缺失技术使病原的毒力基因缺失或者使病原代谢关键基因缺失制备弱毒疫苗，这种策略基因背景清楚、减毒机制明确，同时定点或多片段突变为不可逆突变，毒性很难恢复。因病毒变异快基因型多，病毒性疫苗中应用较少，而多应用于细菌性疾病疫苗生产。Min等[38]构建了G基因缺失重组病毒性出血性败血症病毒，免疫褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼鱼后取得较好的免疫效果，并且该疫苗自然状态下因缺少G基因不能进行复制增殖，致病风险低，可作为预防性疫苗。

2.3 重组亚单位疫苗

重组亚单位疫苗是通过基因重组技术将病原的相关免疫基因体外表达并纯化获得只包含病原体抗原的一类蛋白制剂。这类疫苗不包括毒力因子、安全性高、稳定性好、已经实现商业化生产，但是重组亚单位疫苗免疫效率低，同时在使用过程中需多次免疫并添加佐剂提高免疫效果。目前研究的重组亚单位疫苗主要分为病毒类疫苗、细菌类疫苗、激素类疫苗。由于大部分感染水产动物的病毒基因组已经破译，对编码具有免疫原性的抗原蛋白的基因信息也有一定的了解，因此，当前重组亚单位疫苗研究主要集中在病毒性疫苗。草鱼呼肠孤病毒常见毒株的基因组与编码对应蛋白的功能分析取得一定进展，因此，草鱼呼肠孤病毒的重组亚单位疫苗的研究也大量开展。VP5和VP7是草鱼呼肠孤病毒主要的外衣壳蛋白，研究者对VP5和VP7都进行了大量的免疫原性分析，并评估重组蛋白是否能作为疫苗使用[39-40]。Lu等[41]制备了草鱼呼肠孤病毒VP5和VP7重组蛋白疫苗，混合口服免疫草鱼，产生良好的保护作用，积累死亡率低于10%。田园园等[42]对草鱼呼肠孤病毒GD108的外衣壳蛋白VP4的基因序列进行比对分析、免疫原性分析，推测VP4蛋白有多个B淋巴细胞识别的抗原表位，通过原核表达获得重组VP4蛋白(rVP4)，进行体外中和试验发现，rVP4的多克隆抗体可以有效的中和病毒。之后进行免疫保护试验，发现剂量为3 μg/g的rVP4保护率达到82%，同时检测到鱼体内免疫球蛋白M含量显著增加，VP4蛋白可作为草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗新的候选蛋白。草鱼呼肠孤病毒该类疫苗在国内研究仍停留在实验室阶段，如实现商业化生产，仍需进一步了解编码蛋白的基因信息，选择合适的表达载体高效表达蛋白产物，添加合适的佐剂提高疫苗的免疫保护效果。

2.4 DNA疫苗(核酸疫苗)

DNA疫苗(核酸疫苗)指将某一种或多种编码抗原蛋白的外源基因克隆到真核表达系统的质粒上, 然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内, 质粒能够在其体内复制、转录、翻译成相应的抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的。截至目前，全世界只有针对鱼感染性胰腺坏死病毒的DNA 疫苗在加拿大获得许可并投入商业化使用[43]。研究较多的DNA疫苗多是针对抗原组成简单的病毒，如出血性败血病毒和传染性造血组织坏死病毒的DNA 疫苗，都取得良好的免疫保护效果[44-45]。在草鱼呼肠孤病毒DNA疫苗的研究中主要是对病毒的VP6、VP7基因构建重组质粒并使抗原蛋白在宿主细胞表达量增加，同时评估重组质粒的免疫保护效果[46-49]。刘林等[50]将草鱼呼肠孤病毒的VP6 基因克隆进杆状病毒表达系统，获得核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6，并通过抗体水平测定和免疫保护检测，评估了该核酸疫苗的免疫保护效果高达95%。2014年，李珍[51]构建了双启动子控制双结构基因的蛋白—核酸疫苗表达载体pFastTMDua-VP7-VP6-β-actin，并获得重组杆状病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin。重组病毒感染家蚕卵巢细胞和蚕蛹120 h后检测到成功表达VP7蛋白，然后将感染重组杆状病毒120 h的蚕蛹冷冻干燥制成粉状添入饲料口服免疫鱼体，通过RT-PCR和免疫组化法验证重组杆状病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin能够成功的进入鱼体，并表达抗原基因VP6，该研究预示蚕体表达的蛋白可作为口服蛋白疫苗，同时也预示该重组病毒可作为核酸疫苗。

DNA疫苗制备过程简便，且效率较高，一次肌肉注射可以达到持久免疫保护效果。同时也有研究表明，口服DNA疫苗也能起到较好的免疫效果。但目前DNA疫苗的安全性存在很大的争议，质粒在鱼体内持续表达的时间长短，长时间表达对机体是否有其他副作用，质粒外源基因能否整合到宿主细胞染色体上等。由于质粒在宿主体内不可控，出于安全性考虑，国内限制DNA疫苗的应用。

表2 不同类型草鱼呼肠孤病毒疫苗制备、接种及优缺点比较

3 展 望

我国水产品养殖种类丰富，产量稳步增长，满足国内生产需求的同时对国外市场贡献显著。随着水产品出口比例增加，我国农业部提出无公害水产品养殖，对渔药进行明确规范，抗生素和化学药物的残留监控体系逐步建立，渔用疫苗在水产养殖疾病预防中不仅具有实用的学术价值，而且有广泛的应用前景。我国目前在草鱼呼肠孤病毒的疫苗研发和应用中都已具备了一定的基础，相关的灭活疫苗和减毒活疫苗都取得较好的免疫效果，目前生产上应用较广泛的为灭活疫苗。但随着草鱼集约化养殖规模的扩大和新型病毒的出现，现有的传统疫苗不能满足草鱼养殖业的发展，与此同时随着DNA重组技术的发展和完善，以基因工程为手段研发的基因工程疫苗，如一些亚单位疫苗、病毒活载体疫苗和利用反向遗传学技术构建的基因缺失疫苗迅速发展，虽然目前大多处于实验室研发阶段，但是具有非常广阔的发展前景和应用价值。

我国研究生产推广渔用疫苗中大多遇到以下困难，如接种方式多采取注射，不仅耗时耗力，而且接种对象一般是是幼鱼，渔民在使用时操作不当会对鱼体造成伤害或引发其他病原的感染；疫苗成本高、不易保存、或针对单一病原，大多数渔民不会首选疫苗进行防病；疫苗大规模生产工艺、疫苗推广体系不成熟，大多数研究成果只在实验室应用无法走进养殖场。为了解决这些问题，可采用碳纳米管、海藻酸钠等新兴生物材料包埋疫苗，通过口服免疫鱼体或采用超声波辅助浸泡免疫等高效导入技术；运用基因工程技术研发多价多联疫苗预防多种病原菌感染；跟紧国际前沿结合我国生产实际，开创独特的生产工艺，将实验室研制转向工厂化生产，进而在渔业养殖中应用和推广，以实现渔业疫苗产业化及生产应用。

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AReviewofResearchandDevelopmentofVaccineagainstGrassCarpReovirus

GAO Yan，PEI Chao，ZHANG Chao，LI Zheng，KONG Xianghui

( College of Fisheries，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China )

grass carp reovirus；vaccine development；immunological prevention

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.023

2016-04-14；

2016-05-21.

河南省高校科技创新团队支持计划项目(15IRTSTHN018)；河南省国际合作项目(144300510017)；河南省水产学重点学科项目(201209).

高岩(1993—), 女, 硕士研究生；研究方向：鱼类免疫和疾病控制.E-mail:13569883402@163.com.通讯作者：孔祥会(1968—), 男,教授,博士；研究方向:水产动物免疫与疾病控制. E-mail: xhkong@htu.cn.

S917

C

1003-1111(2017)02-0237-06