甲壳素发酵液养殖草鱼、鲢鱼幼鱼试验

2017-12-18张志红王菊华戴年华张国华黄江丽丁建南

水产科学 2017年2期

关键词：甲壳素鲢鱼消化酶

张志红，王菊华，戴年华，张国华，黄江丽，黄黄，圣平，丁建南

( 江西省科学院生物资源研究所，江西南昌 330096 )

甲壳素发酵液养殖草鱼、鲢鱼幼鱼试验

张志红，王菊华，戴年华，张国华，黄江丽，黄黄，圣平，丁建南

( 江西省科学院生物资源研究所，江西南昌 330096 )

为研究甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼养殖效果，用商品壳聚糖作参比，基础饲料为对照组，分析甲壳素发酵液对鱼体生长和水质环境等影响。试验结果表明，甲壳素发酵液处理组草鱼和鲢鱼幼鱼质量相对增长率比对照组高36.25%和122.47% (P<0.05)，草鱼体内脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶3种消化酶分别比对照组高144.39%、29.53%和29.75%，鲢鱼体内消化酶比对照组高48.06%以上(P<0.05)。与对照组比较，甲壳素发酵液显著降低水中亚硝态氮(61.84%)、氨态氮(30.06%)、总磷含量(52.43%)，提高了草鱼对嗜水气单胞菌抗性。在试验条件下，甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼起到一定的促生长作用，并能改善水质环境，甲壳素发酵液具有作为微生态制剂开发应用的潜力。

甲壳素发酵液；壳聚糖；消化酶；嗜水气单胞菌

甲壳素大量存在于节肢动物如虾、蟹和昆虫外壳中，也存在于菌类、藻类和高等植物的细胞壁中，分布极其广泛，是保健食品、医用材料以及化妆品行业重要原料[1]。壳聚糖又称为脱乙酰甲壳质、可溶性甲壳素、甲壳胺等，是由甲壳素脱乙酰基后生成的直链多糖，具有良好的生理活性和生物相容性[2]。壳聚糖作为饲料添加剂在动物养殖上应用，具有调控营养物质代谢、促进生长、增强抗氧化能力和提高抗病及免疫能力等作用，可部分替代抗生素等化学药物，对推动动物养殖业可持续、健康发展十分有益[3-4]。甲壳素通过化学方法制备壳聚糖，因能耗高、环境污染严重越来越受到限制[5]。利用微生物降解甲壳素生产壳聚糖，降解产物丰富，操作过程安全环保。本试验选用商品壳聚糖和课题组研制的甲壳素微生物发酵液，研究其在草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲢鱼 (Hypophthalmichthysmolitrix)养殖中的效果，比较两种壳聚糖产品对淡水鱼生长性能、抗病能力和水质的影响，为提高渔业养殖技术、开发新产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鱼苗：草鱼和鲢鱼幼鱼购于江西省水产科学研究所，体质量约50 g，体质健壮、规格整齐。

饲料：购于江西省南昌市鑫泰饲料有限公司，主要成份含量为粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥8.5%，总磷≥0.60%，粗纤维≤10.0%，粗灰分≤11.0%，水分≤13.0%。

病原菌：草鱼病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，购于上海海洋大学。甲壳素发酵液：是由3种芽孢杆菌(Bacillus)和1种酵母菌(Saccharomycessp.)联合降解胶质甲壳素得到的发酵液。发酵液中甲壳素降解为不同链长度的壳聚糖(脱乙酰度≥65%)，4种微生物含量≥1.0×109个/mL，含有大量脱乙酰酶和几丁质酶。

商品壳聚糖：购于山东青岛海良生物制品有限公司，脱乙酰度为99%。

1.2 试验方法

1.2.1 养殖试验

试验于室外4 m2、深0.5 m的水泥池中进行，设投喂甲壳素发酵液处理组(按池水量0.02%投入，每7 d泼洒一次)、投喂壳聚糖处理组(在基础饲料中添加0.1%)、对照组(基础饲料)，每组放草鱼40尾，鲢鱼10尾，每组3个重复。按初始鱼体质量的3%投喂基础饲料，每日上下午各1次。驯养至摄食正常后，开始正式试验。养殖水源为地下水，试验过程中，池水日充气时间约10 h。养殖60 d后，全部幼鱼称量质量。

1.2.2 草鱼攻毒试验

养殖试验结束后，每个处理选择20尾草鱼放入90 cm×75 cm×60 cm的室内水族箱内，温度约25 ℃，进行攻毒试验。菌种活化3次，经预试验确定攻毒密度为4×107个/mL，按每尾0.1 mL，腹腔注射嗜水气单胞菌液。每日记录攻毒之后草鱼的累积死亡数。按下式计算各处理相对保护率[6]。

相对保护率/%=(1-处理死亡率/对照死亡率)×100%

1.2.3 水质测定

室外养殖试验结束后，测定水体中氨氮、亚硝态氮和总磷含量，氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法，总磷采用钼酸铵分光光度法，亚硝态氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[7]。

1.2.4 幼鱼体内消化酶测定

养殖试验结束后取饥饿1 d的幼鱼，用南京建成生物工程研究所试剂盒测定鱼体内淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。从每个处理组中随机取幼鱼6尾，取出全肠和肝胰脏，将全肠和肝胰脏一起称量质量，置于匀浆器中，加入10倍体积的高纯水匀浆，于冰箱中4 ℃静置过夜。4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液置于冰箱中4 ℃待用[8]。脂肪酶活性测定以37 ℃条件下每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1 个酶活力单位(U)。蛋白酶活性测定以每毫克组织蛋白37 ℃每分钟水解生成1 μg氨基酸作为1个酶活力单位(U)。淀粉酶活性采用碘—淀粉比色法，以组织中每毫克蛋白在37 ℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位(U)。

1.3 统计分析

试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS V8软件Duncan氏法进行多重比较，P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 甲壳素发酵液对幼鱼生长和抗病能力的影响

幼鱼饲养60 d后甲壳素发酵液和壳聚糖处理组草鱼质量相对增长率分别比对照组高36.25%和24.26%，鲢鱼为122.47%和72.3%，说明甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼均有促进生长效果，与商品壳聚糖和对照组差异显著(P<0.05)(表1)。

表1 不同处理对草鱼和鲢鱼生长的影响

注：同列数据肩标有不同小写字母表示差异达到显著性(P<0.05).

攻毒1 d后对照组草鱼死亡率达90%，第10 d全部死亡，甲壳素发酵液和壳聚糖处理组草鱼死亡率较低，相对保护率分别达到70%和65%。甲壳素发酵液有减轻病原菌侵害，提高草鱼抗病能力、持续保护幼鱼和降低死亡率效果(表2)。

表2 草鱼幼鱼感染嗜水气单胞菌后死亡情况

2.2 甲壳素发酵液对草鱼和鲢鱼幼鱼消化酶的影响

从3种消化酶测定结果看，甲壳素发酵液处理组的草鱼体内脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶均显著高于对照组和壳聚糖组(P<0.05)，分别比对照组高144.39%、29.53%和29.75%，分别比壳聚糖处理组高13.76%、18.51%和6.23%(表3)。同样，甲壳素发酵液处理组鲢鱼体内3种消化酶显著高于对照组(P<0.05)，甲壳素发酵液明显促进了草鱼和鲢鱼幼鱼体内消化酶活力。

表3 不同处理对草鱼和鲢鱼体内消化酶影响

注：同列数据肩标有不同小写字母表示差异达到显著性(P<0.05).

2.2 甲壳素发酵液对养殖水体的影响

与对照组比较，甲壳素发酵液处理组水体中氨氮、亚硝态氮和总磷含量分别降低61.84%、30.06%和52.43%，差异显著(P<0.05)；壳聚糖处理组分别比对照组降低1.08%、3.92%和2.22%(P>0.05)(表4)。甲壳素发酵液改善水质效果好于壳聚糖处理组。

表4 不同处理对养殖水体参数的影响

注：同列数据肩标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

3 讨论

3.1 甲壳素发酵液对促进幼鱼生长的影响

大量研究表明壳聚糖应用于水产动物养殖，具有改善动物摄食性能、促进机体生长效果。有研究发现[6]，草鱼饲料中添加壳聚糖能显著促进草鱼生长。于东祥等[9]在对真鲷(Pagrosomusmajor)幼鱼的试验中比较壳聚糖与腐植酸钠、海藻酸钠等不同添加剂对幼鱼生长影响，壳聚糖处理组比对照组体质量增28.03%，效果好于其他添加剂。壳聚糖对水产动物促生长作用主要表现为提高消化酶活性，研究认为提高肠道消化酶活性是壳聚糖促进鱼体生长的重要原因之一[10]。本试验中，甲壳素发酵液和商品壳聚糖均能提高3种消化酶活性，进而提高草鱼和鲢鱼生长速度。甲壳素发酵液不仅含有壳聚糖、脱乙酰酶、几丁质酶等活性物质，而且还有芽孢杆菌和酵母菌等有益微生物，促生长效果比壳聚糖处理组明显。研究认为芽孢杆菌定殖在肠道后刺激肠道内壁，增加内源性消化酶的分泌，提高消化吸收能力，保证机体快速生长[11-12]。

3.2 甲壳素发酵液对提高幼鱼抗病能力的影响

闫大伟等[6]研究表明壳聚糖可提高草鱼抗病(嗜水气单胞菌)能力，且随着壳聚糖添加量的增加呈先升后降的趋势。Anthi等[13]在饲料中添加壳聚糖连续饲喂鲮鱼(Cirrhinamolitorella)30、60、90 d后注射嗜水气单胞菌，结果表明壳聚糖处理的鱼体明显提高了抗病能力，随着壳聚糖处理时间延长抗病能力增强。水产养殖中应用的芽孢杆菌可抑制副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和哈维弧菌(V.harveyi)等病原菌繁殖[14]，提高肠道中有益菌群乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)含量[15]，增强消化系统稳定性和自身调节能力，改善肠道微生态环境。芽孢杆菌也能提高机体免疫相关酶如超氧化物歧化酶和酚氧化酶等活性[16]。本次试验结果表明，甲壳素发酵液能明显提高草鱼幼鱼抗嗜水气单胞菌的能力，减轻病原菌侵害，保护幼鱼、降低死亡率。

3.3 甲壳素发酵液对水质的影响

水质环境优劣是水产动物养殖成败的关键，在养殖过程中各种残饵和排泄物影响水质，引起水产动物死亡[17]。壳聚糖广泛应用在废水处理中，可作为吸附剂、絮凝剂及抑菌剂等[18-19]。任秀芳等[20]在水体中添加羧化壳聚糖，能显著降低水体中氨氮、硫化氢、亚硝态氮的含量，孙艳辉等[21]在体外模拟条件下，研究了壳聚糖对亚硝态氮的清除作用，随壳聚糖用量增加对亚硝态氮清除能力也升高。芽孢杆菌对水质改善也有一定效果，李永芹等[22]研究表明，芽孢杆菌对养殖水体中氨氮和亚硝态氮的降解率分别为81.9%和64.3%，对净化养殖池塘水质有明显作用。张峰峰等[23]研究认为芽孢杆菌可迅速有效的降低水体中的硝态氮、亚硝态氮含量，4 d去除率均达99%以上，可有效降低水体pH值。本试验中甲壳素发酵液处理显著降低水体中氨氮、亚硝态氮和总磷含量，对养殖水体改善具有显著效果。

致谢

感谢江西省水产科学研究所章海鑫等同志对本研究给予的指导和帮助。

[1] Jayakumar R, Menon D, Manzoor K, et al. Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials—a short review[J].Carbohydrate Polymers, 2010, 82(2):227-232.

[2] Majeti N V, Ravi K. A review of chitin and chitosan applications[J].Reactive and Functional Polymers, 2000, 46(1):1-27.

[3] 高巍,陈帅,丁兆坤,等.饲料中添加壳寡糖对动物机体的影响[J].动物营养学报,2014,26(2): 322-326.

[4] 刘勇,龚建海,魏能.壳聚糖在水产养殖中的研究进展[J].饲料工业,2011,32(20):62-64.

[5] 柏正武,付克勤,宾琴,等.不同分子量超高脱乙酰度壳聚糖的制备[J].武汉工程大学学报,2014,36(8):16-19.

[6] 闫大伟,华雪铭,周洪琪,等.壳聚糖对草鱼生长、抗病性能的影响[J].饲料工业,2007,28(12):17-18.

[7] 陈佳荣. 水化学实验指导书[M].北京:中国农业出版社,1998:115-152.

[8] 华雪铭,周洪琪,张宇峰,等.饲料中添加壳聚糖和益生菌对暗纹东方鲀幼鱼生长及部分消化酶活性的影响[J].水生生物学报,2005,29(3):299-305.

[9] 于东祥,柳学周,雷霁霖.甲壳胺制剂对真鲷幼鱼的促生长作用研究[J].海洋水产研究,2000,21(3):62-66.

[10] 陈勇,周洪琪,冷向军,等.壳聚糖对异育银鲫生长和消化酶的影响[J].中国水产科学,2006,13(3):440-445.

[11] Zokaeifar H, Balaczar J L, Saad C R, et al. Effects ofBacillussubtilison the growth performance,digestive enzymes,immune gene expression and disease resistance of white shrimp,Litopenaeusvannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2012,33(4):683-689.

[12] 牛凤池,黄燕华,曹俊明,等.5种添加剂对黄颡鱼生长性能、体成分及血清生化指标的影响[J].动物营养学报,2015,27(7):2176-2183.

[13] Aathi K, Ramasubramanian V, Uthayakumar V,et al. Effect of chitosan supplemented diet on survival, growth,hematological,biochemical and immunological responses of Indian major carpLabeorohita[J].International Research Journal of Pharmacy 2013,4(5):141-146.

[14] 韦露,陈偿,龙云映,等. 一株短小芽孢杆菌B1的筛选鉴定及其抗菌特性研究[J]. 水产科学,2015,34(3):161-168.

[15] Goren E, Dejong W A, Doomenbal P, et al. Protection of chicks againstSalmonellainfection induced by spray application of intestinal microflora in the hatchery[J]. Veterinary Quarterly,1984, 6(2):73-79.

[16] 关晓燕,陈仲,赵春霞,等.一株芽孢杆菌的分离、鉴定及其对仿刺参免疫的影响[J]. 水产科学，2015,34(9):565-570.

[17] 宋超,孟顺龙,范立民,等.中国淡水池塘养殖面临的环境问题及对策[J].中国农学通报,2012,28(26): 89-92.

[18] Nan H, Renbi B. A novel amine-shielded surface cross-linking of chitosan hydrogel balds for enhanced metal adsorption performance[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research,2005,44(17):6692-6700.

[19] 刘秉涛,张焱,王海荣.壳聚糖对含蛋白废水的絮凝与回收[J].华北水利水电学院学报, 2005, 26(4):69-71.

[20] 任秀芳,柏爱旭,张萍,等.壳聚糖对水质和克氏原螯虾仔虾非特异性免疫酶的影响[J].江苏农业科学,2013,41(9):202-204.

[21] 孙艳辉,董英.壳聚糖对亚硝酸盐清除作用的研究[J]. 食品科学,2005, 26(12):71-73.

[22] 李永芹,许乐乐,陈克卫.1株芽孢杆菌的筛选鉴定及其净水效果研究[J].水生态学杂志, 2013, 34(1): 96-99.

[23] 张峰峰,谢凤行,赵玉洁,等.枯草芽孢杆菌水质净化作用的研究[J].华北农学报,2009,24(4):218-221.

EffectsofChitinFermentationLiquidonGrassCarpandSilverCarp

ZHANG Zhihong, WANG Juhua, DAI Nianhua, ZHANG Guohua, HUANG Jiangli, HUANG Huang, SHENG Ping, DING Jiannan

( Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330029, China )