益生菌对凡纳滨对虾免疫功能及肠道菌群的影响

孟霄鹏，孟 阳，王 悦，杨 硕，袁春营，崔青曼

( 天津科技大学 海洋与环境学院，天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457 )

益生菌对凡纳滨对虾免疫功能及肠道菌群的影响

孟霄鹏，孟 阳，王 悦，杨 硕，袁春营，崔青曼

( 天津科技大学 海洋与环境学院，天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457 )

以类芽孢杆菌和双歧杆菌为益生菌，添加到凡纳滨对虾(平均体质量3.45 g)的饲料中，饲养28 d(水温25～27 ℃，盐度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L)，采用南京建成试剂盒和变性梯度凝胶电泳技术，研究益生菌对凡纳滨对虾免疫功能及肠道菌群的影响。结果表明，益生菌能够显著提高对虾血清过氧化物酶(对照组43.22 U/mL，试验组76.33 U/mL)、超氧化物歧化酶(对照组60.61 U/mL，试验组101.18 U/mL)、一氧化氮合酶(对照组7.54 U/mL，试验组12.44 U/mL)、酸性磷酸酶(对照组0.0446 U/mL，试验组0.0574 U/mL)和碱性磷酸酶(对照组0.0183 U/mL，试验组0.0236 U/mL)的活性 (P<0.01)，明显改善对虾肠道的菌群组成，从而提高对虾抵抗疾病的能力。

类芽孢杆菌；双歧杆菌；凡纳滨对虾；免疫学指标；肠道菌群

近年来，随着凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)集约化养殖的迅猛发展，水环境恶化和种质退化导致病害频发，抗生素及其他违禁药物引起的细菌抗药性及药物残留等问题，影响了对虾养殖业的健康稳定发展。为了解决养殖病害和食品安全等诸多矛盾，寻找绿色环保的抗生素替代品成为研究的热点[1-2]。

益生菌是一类能定殖于宿主肠道内、能产生健康功效，改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。目前微生态活菌制剂在对虾养殖生产中大多应用于水质调控，作为对虾饲料添加剂以能耐高温高压的芽孢杆菌属为主[3-6]。对虾独有的免疫系统，只能通过提高机体免疫力抵抗外界病害的侵袭。本研究从对虾肠道中分离类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)，与双歧杆菌(Bifidobacteriussp.)配伍制备益生菌，应用于凡纳滨对虾养殖，探讨益生菌对对虾生长、机体免疫力和肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用益生菌为自行研制，成分组成：类芽孢杆菌和双歧杆菌(比例为1∶1，菌体数2.2×109cfu/mL)，其中类芽孢杆菌由养殖对虾肠道分离纯化得到，双歧杆菌由天津海河乳业的酸奶中分离得到。试验用凡纳滨对虾虾苗由天津鑫永丰水产养殖有限公司提供。试验饲料为广东海大集团股份有限公司生产。

主要仪器：立式蒸汽灭菌器(上海迅博业实有限公司)，超净工作台(上海跃进医疗器械厂)，紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，T100TMPCR仪(美国热电公司)，ChemiDoc XRS凝胶成像仪(美国热电公司)，DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2 方法

本试验设置1个试验组(每千克饲料中加入0.1 mL益生菌)和1个对照组(未添加益生菌)。每组设3个平行，共计6个处理组。正式试验前，对虾放于室内海水循环系统中暂养，并以试验对照饲料饱食投喂。暂养8 d后进行养殖试验，每个水族箱中投放虾30尾。

28 d饲养试验，每日6:00、11:00、18:00和23:00按对虾体质量的5%～6%投喂，且根据对虾的摄食情况适当调整。各时间点投喂量占日总投饵量的比值分别为30%、20%、30%和20%。饲养期间连续充气，水温25～27 ℃，盐度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

养殖试验结束时，分别对每个重复对虾进行计数，称量质量，计算对虾的存活率及特定生长率：

成活率/%=Nt/N0×100%

特定生长率/%·d-1= (lnmt——lnm0)/t×100%

式中，N0和Nt分别为每个重复对虾初始尾数和终末尾数，m0和mt分别为初始体质量和终末体质量(g)，t为试验天数(d)。

1.2.1 对虾血淋巴免疫学指标的测定

1.2.1.1 抗凝血的制备

从每个重复中随机取出5～6尾虾，自腹窦取血，血淋巴与抗凝剂的比例为1∶2，离心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得上清液用于测定免疫指标。

1.2.1.2 对虾血清中过氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性的测定

过氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性均采用南京建成试剂盒测定。

过氧化物酶的活性定义为：以37 ℃条件下，每毫升血清(血浆)每分钟催化1 μg底物的酶量定义为1个酶活力单位 (U)。

以每毫升血清中超氧化物歧化酶抑制率达到50%时所对应的超氧化物歧化酶量为1个超氧化物歧化酶活力单位(U)。

以每毫升血清每分钟生成1 nmol 一氧化氮为1个一氧化氮合酶活力单位(U)。

以1 mL血清在37 ℃与基质作用30 min，产生1 mg酚为1个酸性磷酸酶活力单位(U)。

以1 mL血清在37 ℃与基质作用15 min，产生1 mg酚为1个碱性磷酸酶活力单位(U)。

1.2.2 肠道菌群的变性梯度凝胶电泳分析

1.2.2.1 样品的采集与处理

75%乙醇体表消毒，活体解剖，用镊子挤压肠道，将内含物挤出，同时将肠道剪碎，一并放置于预冷的磷酸缓冲液中，4 ℃静置2～4 h，3000 r/min离心10 min，将上清液放置于50 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集沉淀用于后续试验。

1.2.2.2 总DNA的提取与纯化

采用AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒(爱思进生物技术有限公司)，提取总DNA。DNA纯化采用天根公司生产的通用型DNA纯化回收试剂盒。琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.2.3 PCR扩增

采用16S rDNA V3高变区序列的通用引物，进行总DNA的PCR扩增。引物：341F(5′段连接GC夹)：5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′，534R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

采用降落 PCR 进行扩增：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃，45 s，72 ℃，45 s，每个循环退火温度降低1 ℃，当退火温度降至55 ℃ 后，再以该温度扩增25个循环；最后72 ℃补平10 min[7]。PCR 产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测。

1.2.2.4 变性梯度凝胶电泳

纯化后的PCR产物上样进行8%的变性梯度凝胶电泳(变性梯度35%～55%)，温度60 ℃，恒压150 V，电泳6 h，溴化乙锭染液染色30 min，凝胶成像系统观察并拍照，进行切胶。切完后放进2 mL离心管内，加入1 mL无菌水冲洗2次，冲洗完毕后加入30 μL超纯水，-20 ℃冷藏过夜后，将离心管12 000 r/min离心10 min，取上清液作为变性梯度凝胶电泳条带回收后的模板再进行PCR扩增，PCR产物送至北京奥科鼎盛生物公司测序，将测序结果通过Blast进行比对分析，选取与PCR序列相似度最高的一个GenBank收录序列，对比分析对照组和试验组凡纳滨对虾肠道菌群。

2 结果与分析

2.1 益生菌对凡纳滨对虾生长及存活率的影响

试验组的对虾存活率和特定生长率均高于对照组，说明添加益生菌降低了凡纳滨对虾的死亡率，提高其特定生长率(表1)。

表1 试验凡纳滨对虾存活率和特定生长率

2.2 益生菌对凡纳滨对虾5项免疫学指标的影响

添加益生菌组的凡纳滨对虾血清的过氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.01)(图1～图5)，其中试验组对虾过氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶的活性均随着时间的延长而升高，14 d以后升高缓慢，试验组对虾的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性在14 d时均最高，28 d时略微下降，说明该益生菌可以明显提高凡纳滨对虾血清的非特异性免疫指标，提高对虾机体的免疫力。

图1 益生菌对凡纳滨对虾血清过氧化物酶活性的影响与对照组相比较，*P < 0.05, **P < 0.01.下同.

图2 益生菌对凡纳滨对虾血清超氧化物岐化酶活性的影响

图3 益生菌对凡纳滨对虾血清一氧化氮合酶活性的影响

图4 益生菌对凡纳滨对虾血清酸性磷酸酶活性的影响

图5 益生菌对凡纳滨对虾血清碱性磷酸酶活性的影响

2.3 益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群的影响

对照组和试验组对虾肠道细菌基因组图谱见图6，对虾肠道菌群的16S rDNA电泳图谱见图7，将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分析，结果见图8、表2和表3。从图谱中亮度和位置可看出二者不同的优势菌群的差异。对照组对虾肠道的优势菌群主要是玫瑰杆菌(Rosebacter)和弧菌(Vibrio)，而试验组凡纳滨对虾肠道中优势菌群主要是类芽孢杆菌、双歧杆菌和弧菌等。对照组对虾肠道的细菌种类主要属于变形菌门，试验组凡纳滨对虾肠道中的细菌种类属于厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门，微生物种类明显增加，且益生菌占居优势地位。

图6 试验凡纳滨对虾肠道细菌基因组图谱1为对照组，2为试验组.

图7 试验凡纳滨对虾肠道菌群的16S rDNA电泳图谱1、2、3为对照组，4、5、6为试验组.

图8 试验凡纳滨对虾肠道菌群的变性梯度凝胶电泳图谱左侧为对照组，右侧为试验组.

编号比对相似度/%亲缘关系CT1假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)(AB793704．1)89变形菌门CT2未能培养的γ⁃变形菌克隆(JX966218．1)95γ⁃变形菌门CT3弧菌(FR821229．1)98变形菌门CT4发光弧菌(KP319180．1)94变形菌门CT5未能培养的α⁃变形菌(JQ974826．1)92α⁃变形菌门CT6弧菌(JQ665318．1)94变形菌门CT7未能培养的细菌克隆(KF799155．1)98未知细菌CT8玫瑰杆菌(DQ479380．1)100变形菌门CT9未能培养的红环菌科细菌克隆(GQ324225．1)94变形菌门CT10克雷伯菌属(Klebsiella)(FJ823022．1)92γ⁃变形菌门CT11玫瑰杆菌(DQ479380．1)94变形菌门CT12未能培养的细菌克隆(KC884574．1)92未知细菌CT13未能培养的细菌克隆(JQ197251．1)90未知细菌CT14弧菌(FR821230．1)95变形菌门

表3 试验组凡纳滨对虾肠道微生物16S rDNA-V3的序列分析

3 讨 论

3.1 益生菌对凡纳滨对虾免疫功能的作用

益生菌为抗生素的替代品，应用发展迅速[1,8-9]。在饲料中添加益生菌，不同程度提高了凡纳滨对虾的血清酚氧化酶活力、溶菌酶活力和总抗氧化力等免疫指标[10-11]及淀粉酶、脂肪酶等消化酶活性[12]；在凡纳滨对虾养殖水体中投入微生态制剂，明显增强对虾血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、抗菌活力和溶菌活力[13]。温俊等[14]在饲料中添加合生素，研究了其对凡纳滨对虾肠道菌群和免疫机能的影响，证实合生素能显著提高凡纳滨对虾酚氧化酶活力和碱性磷酸酶活力。郝凯[15]分析了健康凡纳滨对虾的肠道微生物菌群，通过溶血试验、产酶试验、拮抗试验和安全性评价，筛选获得3株潜在益生菌，分别为鲍鱼希瓦氏菌(Shewanellahaliotis)、腊样芽孢杆菌(B.cereus)和双壳气单胞菌(Aeromouasbivalvium)，通过在饲料中添加单一菌体和按一定比例混合的菌体，研究其对凡纳滨对虾免疫机能、生长性能和抗病力的影响，结果表明，双壳气单胞菌能够显著性提高呼吸爆发活性、酸性磷酸酶活性和溶菌酶活力，混合菌组能够显著提高呼吸爆发活性和酸性磷酸酶活力，鲍鱼希瓦氏菌和双壳气单胞菌能够显著上调proPO和LGBP基因的表达，混合菌能够显著上调PE-3a基因的表达，双壳气单胞菌和混合菌能够显著提高凡纳滨对虾的抗病力，不同处理组的凡纳滨对虾质量增加显著，其中混合菌的质量增加效果最好。本研究也得到了类似的结果，益生菌能够明显增强凡纳滨对虾血清的过氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性，提高了对虾的防病能力和成活率。

3.2 益生菌改善凡纳滨对虾肠道菌群的作用

变性梯度凝胶电泳技术有无需培养、分辨率高、结果准确、重复性好、检测速度快、同时检测多种微生物等优点，已成为微生物分子生态学研究的主要方法之一，广泛应用于微生物群落结构的研究，包括土壤、植物根系、海洋、温泉、人体和动物肠道等。王亭芳等[16]采用变性梯度凝胶电泳技术分析7—9月凡纳滨对虾养殖水体中微生物的种类，优势种属于变形菌门和厚壁菌门。温俊等[14]研究发现，合生素能调节凡纳滨对虾肠道微生物群落结构，稳定肠道的微生态环境。在饲料中添加中草药和芽孢杆菌，投喂56 d后，发现中草药和芽孢杆菌促进了凡纳滨对虾的生长，且共同添加的效果好于单独添加，同时改变了对虾肠道细菌的数量和组成[17]。张盛静等[18]在饲料中添加地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，研究其对凡纳滨对虾肠道菌群、Toll 受体及溶菌酶基因表达量和抗哈维氏弧菌(V.harveyi)能力的影响，结果表明，地衣芽孢杆菌可显著提高对虾抗哈维氏弧菌感染的能力，显著降低对虾肠道内弧菌数量，感染哈维氏弧菌后，试验组溶菌酶mRNA 的相对表达量在12、18、24、36、48、72 h 均显著高于对照组，试验组感染哈维氏弧菌后在6、12、18、24、36、48、72和7 d 的Toll 受体mRNA 的相对表达量均显著高于对照组，推测地衣芽孢杆菌可能是通过降低对虾肠道内的弧菌量，并提高抗病相关基因的表达量，从而增强对虾抗哈维氏弧菌感染的能力。笔者采用变性梯度凝胶电泳技术研究发现，对照组凡纳滨对虾肠道中菌群以变形菌门为主，试验组中对虾肠道菌群则为4类菌群，可见外来微生物可明显改变对虾肠道的菌群组成。

4 结 论

通过在饲料中添加益生菌，研究凡纳滨对虾生长、免疫学指标和肠道菌群的变化，证实益生菌能明显提高凡纳滨对虾的特定生长率和存活率，增强凡纳滨对虾过氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶活性、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性，有效改善对虾肠道菌群的组成，提高凡纳滨对虾的特定生长率和存活率，不失为一种良好的对虾用微生态制剂。

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EffectsofProbioticsonImmunologicFunctionsandIntestinalMicroflorainPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

MENG Xiaopeng, MENG Yang, WANG Yue, YANG Shuo, YUAN Chunying, CUI Qingman

( Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry, College of Marine & Environment, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China )

In this paper, bacillus and bifidobacteria were added to the feed of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannamei(average body weight of 3.45 g), and fed for 4 weeks, and the effects of probiotics on immunologic functions and intestinal microflora ofL.vannameiwas studied by Nanjing Jiancheng kit and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology. The results showed that probiotics led to increase activities of peroxidase (control group, 43.22 U/mL; experimental group, 76.33 U/mL), superoxide dismutase (control group, 60.61 U/mL; experimental group, 101.18 U/mL), nitric oxide synthase (control group, 7.54 U/mL; experimental group, 12.44 U/mL), acid phosphatase (control group, 0.0446 U/mL; experimental group, 0.0574 U/mL) and alkaline phosphatase (control group, 0.0183 U/mL; experimental group, 0.0236 U/mL) in Pacific white leg shrimp, obviously improved intestinal bacterial group composition of the shrimp, and the ability of shrimp to resist disease.

Paenibacillussp.;Bifidobacteriumsp.;Litopenaeusvannamei; immunologic function; intestinal microflora

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.010

S968.22

A

1003-1111(2017)01-0060-06

2016-01-21；

2016-04-18.

国家星火计划项目(2011GA610005).

孟霄鹏(1992—)，男，硕士研究生；研究方向：海洋生物资源开发利用. E-mail：meng12@mail.tust.cn. 通讯作者：袁春营(1965—)，男，副教授；研究方向：海洋生物资源开发利用. E-mail：ycy201388@163.com.