一例猪圆环病毒3型病料的PCR检测
2017-12-14张文通苗立中沈志强
魏 凤，李 峰，张文通，苗立中，沈志强，
（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）
一例猪圆环病毒3型病料的PCR检测
魏 凤1，李 峰1，张文通2，苗立中1，沈志强1，2
（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）
为弄清引起山东省沾化县某养猪场病猪多系统衰竭综合征的病原，采用PCR检测及序列测序分析，确诊病原含有猪圆环病毒3型。这个病例的确诊，显示该区域有猪圆环病毒3型的流行，为当地防疫部门开展针对该病防控提供理论依据。
猪圆环病毒3型；PCR；检测
2015年6月，研究人员从美国北卡罗莱纳州某养猪场利用宏基因组测序技术发现了一种新型猪圆环病毒，即猪圆环病毒3型（porcine circovirus type 3,PCV3）[1]。2016年至今，我国多个研究机构如华中农业大学动物传染病研究室、华南农业大学国家生猪育种工程中心、山东农业科学院畜牧兽医研究所等都报道了猪圆环病毒3型在我国流行的情况[2]。
PCV3基因组有2 000个碱基组成，主要编码Cap和Rep两个基因。PCV3 Cap基因编码214个氨基酸残基，Rep基因编码297个氨基酸残基[3]。PCV3 Cap基因编码的氨基酸残基较PCV2少19~20个。PCV3毒株主要分为3a和3b两群，其中3a和美国报道PCV3毒株处于同一进化分支[4]。
目前研究表明，PCV3在我国猪场抗原阳性率高达12.7%，而血清阳性率高达48.02%[4]。PCV3对猪致病性及PCV2疫苗能否阻止PCV3的侵袭已成为从事生猪疫病研究人员迫切需要研究的课题。笔者于2017年9月10日，利用PCR及测序，确诊了从山东省沾化县某猪场送检滨州畜牧兽医研究院门诊的病死猪组织中含有PCV3。
1 材料与方法
1.1 病料
山东省沾化县某猪场病死猪（约60日龄）肺脏及腹股沟淋巴结。
1.2 主要试剂
病毒DNA基因组提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、pMD18-T、BamHI、HindШ 载 体 均购自宝生物工程（大连）有限公司；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；DH5a菌种由滨州畜牧兽医研究院保存。
1.3 引物设计与合成
参照文献[5]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCV3检测引物，PCR扩增核苷酸预期为338 bp。引物序列为：P1：5′-CCACAGAAGGCGCTAT GTC-3′，P2：5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′。
1.4 PCV3的PCR鉴定
将无菌采集的病料组织，按照1∶3比例添加灭菌的0.85%氯化钠水溶液，用匀浆器进行研磨；悬液反复冻融3次；然后以12 000 r/min离心处理；离心的上清液用0.22 μm滤器过滤除菌并保存备用。过滤后的菌液一部分用作提取DNA基因组的模板。
取部分滤液用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。以该基因组为模板，用P1和P2引物进行PCR扩增。PCR扩增 25 μL 体系，具体为：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（20 mmol/L）1 μL、P1 和 P2（引物浓度均 20 μmol/L） 各 0.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、模板DNA 5 μL，添加水至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环后，72℃延伸10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.5 PCV3的PCR产物克隆及序列分析
将扩增到的PCR产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。将回收到的PCR产物，连接到pMD18-T载体上，经BamHⅠ和HindШ双酶切鉴定正确后，送往上海生物工程有限公司进行测序。用DNAStar软件对测序结果与GenBank上报道的PCV2基因核苷酸序列同源性进行分析。
2 结果与分析
2.1 PCV3的PCR鉴定结果
疑似PCV3感染病料的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到了与预期大小338 bp相符的片段，结果见图1。根据PCR鉴定结果初步判定该猪场的病料为PCV3阳性。
图1 PCV3的PCR扩增结果
2.2 PCV3的PCR扩增产物测序结果
将鉴定正确克隆质粒送去上海生工测序。测序结果显示：PCV3的PCR扩增产物338 bp，序列如下：CGACGATTCCACAGAAGGCGCTATGTCAGA AGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGC ACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAAC GTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGC CCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAA CGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTAT AAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTCAGCCCT GTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGT TCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCT GGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTA TGCGGA；将测序结果在 NCBI里进行 Blast，该核苷酸序列与搜索到的其他PCV同源性在97%~99%。
3 讨论
利用PCR及测序确诊感染PCV3的养猪场来自山东省沾化县。该养猪场规模50多头母猪，发病猪零星死亡，多保育阶段仔猪死亡。剖检病变主要为腹股沟淋巴结肿大，切面严重出血；肺脏间质性肺炎；肾脏有坏死点。使用多种抗生素治疗无效。该猪场未进行PCV2苗的免疫。
下一步工作：一是需要弄清该猪场PCV3的来源；二是跟踪调查附近区域猪场PCV3流行情况；三是开展PCV3分离及全基因组测序研究。开展下一步工作的同时，需向有关部门通报PCV3的研究结果，以引起猪场及行业主管的重视。
[1] 翁善钢.一种新的猪圆环病毒—猪圆环病毒3型[J].养猪，2017（4）：64.
[2] 贺会利，李军，潘艳，等.广西首例猪圆环病毒3型的发现及其衣壳蛋白序列分析[J].南方农业学报，2017（8）：1499-1503.
[3] 湛洋，王东亮，王乃东，等.猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析[J].畜牧兽医学报，2017，48（6）：1076-1084.
[4] 咸文，梁海英，曾智勇，摘译.猪圆环病毒3型的鉴定与遗传特征分析[J].猪业科学，2017，34（7）：32-33.
[5] Palinski R,Piñeyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J/OL].J Virol,2016,doi:10.1128/JVI.01879-16.
PCR Detection for One Case of Porcine Circovirus Type 3
WEI Feng1,LI Feng1,ZHANG Wentong2,MIAO Lizhong1,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Binzhou Animal Science＆Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600,China;2.Shandong LvDu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)
To find out pathogen of multisystem failure case from a scale pig farm in Zhanhua county,Shandong Province,the pathogen was diagnosed with porcine circovirus type 3 by polymerase chain reaction diagnosis and sequence sequencing analysis.The diagnosis of this case shows that the area has the prevalence of porcine circovirus 3 and provides a theoretical basis for the prevention and control of the disease in the local epidemic prevention department.
porcine circovirus type 3;polymerase chain reaction;detection
S858.282.65+9.2
A
1002-1957(2017)06-0099-02
2017-10-10
山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（SDAIT-08-17）
魏 凤（1979-），女，河南遂平人，助理研究员，硕士，主要从事兽用生物制品研究.E-mail:hzndzwt1@163.com
（编辑：富春妮）
