蒙山黑土猪及其种群氟烷基因PCR-RFLP检测与分析

谢丽华，戴光文，梁 真，唐国春，黄树新，黄 超，吴颖航

（1.梧州市动物疫病预防控制中心，广西 梧州 543002；2.蒙山县动物疫病预防控制中心，梧州 546700；3.蒙山县强新牲猪专业合作社，梧州 546700；4.广西蒙山金宇特色农业发展有限公司，梧州 546700）

蒙山黑土猪及其种群氟烷基因PCR-RFLP检测与分析

谢丽华1，戴光文1，梁 真1，唐国春2，黄树新3，4，黄 超1，吴颖航1

（1.梧州市动物疫病预防控制中心，广西 梧州 543002；2.蒙山县动物疫病预防控制中心，梧州 546700；3.蒙山县强新牲猪专业合作社，梧州 546700；4.广西蒙山金宇特色农业发展有限公司，梧州 546700）

采用成熟的商品化PCR-RFLP试剂盒检测分析了蒙山黑土猪核心种群、2代种群及2~3代商品猪群的氟烷基因类型。结果显示，核心种群的陆川猪、杜洛克及2代种猪和商品猪均为显性纯合子HalNHalN基因型，核心野猪种群有1头检测为杂合子HalNHaln基因型，全猪群无隐性纯合子HalnHaln基因型。野猪群和全猪群Haln等位基因频率分别为0.033和0.005。结果表明，商品化PCR-RFLP试剂盒可快速准确诊断不同类型猪种的氟烷基因类型，蒙山黑土猪及其种群不表现氟烷敏感临床特征，HalNHalN基因型猪遗传性能稳定。

蒙山黑土猪；氟烷基因；PCR-RFLP

猪氟烷基因（Halothane,Hal）又被称为骨骼肌兰尼定受体基因（Ryanodine Receptor Gene 1,RYR1），是控制猪应激综合征（Porcine Stress Syndrome,PSS）的一个主效基因[1]。猪应激综合征是一种遗传缺陷病，患病猪易发生恶性高热综合征（MHS）而导致猝死；该病也是引起劣质猪肉—白肌肉（Pale Soft Exudative,PSE）和黑干肉（Dark Firm Dry,DFD）的主要原因[2]，给养猪业造成巨大经济损失。Hal基因位于猪的6号常染色体上，是一个不完全显性基因，具有正常显性纯合子（NN）、杂合子（Nn）和突变隐性纯合子（nn）3种基因型，具有重要经济性状和品质性状[3]。其中HalnHaln基因型表现氟烷敏感，易发PSS，严重的可导致猪只死亡；HalNHalN基因型不表现氟烷敏感；HalNHaln基因型不表现氟烷敏感但携带氟烷敏感基因。

不同猪种携带Haln基因的频率不同：国外猪种皮特兰100%、比利时长白猪73.3%、大约克新品系3.8%、丹麦长白猪3.1%[4]；我国地方猪种二脸花猪0.57%[5]、民猪 10%~16.67%[5-7]，梅山猪、内江猪、版纳猪、五指山猪、临高猪、藏猪、香猪均为0[8-10]；亚洲野猪为7.03%[11]。蒙山黑土猪及其种猪陆川猪少见此类文献的公开报道。蒙山黑土猪是一个地方性特色品牌猪种，主要分布于广西蒙山县，是由地方猪种陆川猪与国外血统的杜洛克或人工驯化野猪杂交培育获得，具有皮毛全黑、体型高大、腿臀健壮、产仔数多、耐粗性强、抗逆性强、瘦肉率高、肉质细嫩、营养多汁、口味清香等特点。本研究采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）技术检测了Hal基因在蒙山黑土猪核心种群、2代种群及商品猪中的分布状况，为优质黑土猪的繁殖选育和遗传资源的合理开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蒙山县强新牲猪专业合作社于2015—2017年养殖的黑土猪核心种猪60头（其中陆川猪40头，杜洛克5头，野猪15头）、HalNHalN基因型核心种猪繁育的2代种猪30头、2代和3代商品猪共10头。采集上述猪血液，待血凝后置于4℃保存，取血凝块作为样品。

1.2 试验时间与地点

试验于2015—2017年在梧州市动物疫病预防控制中心进行。

1.3 主要仪器

阿尔泰BHC-1300ⅡA2二级生物安全柜、德国Brand微量移液器、珠海Hema 9600 PCR仪、珠海HemaTGL-18R台式冷冻离心机、北京君意JY600C电泳仪、以色列E-Gel Imager核酸凝胶成像系统等。

1.4 试剂与方法

采用北京世纪元亨猪应激基因PCR-RFLP检测试剂盒A盒抽提血液基因组DNA，用B盒进行PCR-RFLP。

1.4.1 全基因组提取 将血凝块捣碎，取100~200 μL血样放于离心管中，加入300 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56℃水浴中消化1 h。加入300μLDNA结合液，颠倒混匀，12000r/min离心5min。取上清液全部倒入吸附柱中，室温静置3 min，10 000 r/min离心30 s。弃去收集管中液体，加入500 μL DNA 洗涤液，10 000 r/min 离心 30 s，重复该步骤1次。弃去收集管中液体，10 000 r/min空柱离心1 min，除去残留的DNA洗涤液。将吸附柱放入新的1.5 mL离心管中，向柱中央加入DNA洗脱液50 μL，室温放置 2 min，10 000 r/min 离心 30 s，离心管中液体即为DNA模板。

1.4.2 PCR反应及酶切鉴定 PCR反应体系20 μL：16 μL PCR 反应液，2 μL Taq DNA 聚合酶，2 μL 模板DNA。设无菌水为阴性对照。PCR扩增程序：94℃3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。酶切：每份总体积 20 μL，7.8 μL 无菌无核酸酶水，2 μL内切酶缓冲液，0.2 μL内切酶，10 μL PCR产物，混匀，37 ℃温浴1 h。

取5 μL PCR产物及10 μL酶切产物分别点样于1%的琼脂糖凝胶孔中，电泳，核酸染色，紫外灯下观察结果。酶切产物结果判定：被检样品出现493 bp、166 bp 为HalNHalN，出现 659 bp、493 bp、166 bp为 HalNHaln，出现 659 bp 为 HalnHaln。

1.5 数据统计

根据群体遗传学理论直接计算得到基因型和等位基因频率。

2 结果与分析

2.1 Hal基因PCR扩增电泳结果

PCR产物电泳后，所有种群的被检样品孔均出现659 bp的特异性条带，阴性对照孔未出现条带，说明Hal基因得到有效扩增，扩增没有受到污染干扰，结果见图1。

图1 Hal基因PCR扩增电泳图

2.2 Hal基因RFLP酶切鉴定结果

酶切产物电泳后，除了1头野猪样品孔（第6孔道）出现659 bp、493 bp、166 bp 3个条带外，其余所有被检样品孔只有493bp、166bp2个条带，未出现659bp 1个条带，阴性对照无酶切条带。出现3个条带的野猪样品为HalNHaln基因型，其余均为HalNHalN基因型，未发现HalnHaln基因型，结果见图2。

图2 Hal基因RFLP酶切电泳结果

2.3 基因型和等位基因频率分布

氟烷基因型和等位基因频率分布见表1。检测结果表明，核心种群的陆川猪、杜洛克及2代种猪和2代、3代商品猪均为显性纯合子HalNHalN基因型，仅有1头野猪检测为杂合子HalNHaln基因型，无隐性纯合子HalnHaln基因型。野猪Haln等位基因频率为0.033，群体总Haln等位基因频率为0.005。

表1 不同猪群Hal基因型和等位基因频率分布

3 讨论

3.1 猪氟烷基因的特点、作用及对蒙山黑土猪资源开发的指导意义

氟烷基因的特点是不完全显性遗传，具有显性纯合子（NN）、杂合子（Nn）和隐性纯合子（nn）3种基因型，表现出多效经济特性。其主要作用有3个方面：1）影响猪肉品质。Hal基因是调控猪肉品质的一个主效基因，是产生PSE肉（即肉色灰白、肉质松软、有渗出物）和DFD肉（即肌肉干燥、质地粗硬、色泽灰暗）的遗传基础。隐性纯合子nn型的猪对环境的刺激因素敏感，在高热、长途运输、饥饿、争斗、配种、预防注射、驱赶、混群等应激因子的作用下会诱发高热综合征而猝死[10]，肌肉pH异常降低，产生高频率的劣质肉（PSE肉和DFD肉）。nn型对猪肉另一个负效应表现在肉中的可溶性蛋白和肌间脂肪较低，使肉失去原有的口感风味[12-13]。2）影响猪的繁殖性能。Webb 等[14]、蒋思文等[15]、姜勋平等[16]报道，氟烷基因的NN型和Nn型个体的繁殖性能优于nn型个体。鞠慧萍等[17]报道，氟烷基因NN型的经产母猪产仔数和产活仔数均显著高于Nn和nn型。3）影响猪的生长性状。李林祥等[18]报道了前人研究结果，指出nn型猪只日增重显著高于NN型和Nn型，NN型猪只的生长速度最慢，3种基因的日增重速度存在显著的差异；Leach等发现NN和Nn基因型的猪日增重差异不显著，但料重比Nn型猪明显低于NN型。徐晓波等报道氟烷阳性猪（nn型）的日增重和饲料报酬率较低，但屠宰率、眼肌面积和瘦肉率较高[19]。报道结果不完全一致，可能与日增重受多个基因作用，而不同研究所使用的猪的遗传背景、饲养管理和环境条件有差异等诸多因素有关。多数报道倾向于携带Haln基因的猪在日增重、饲料报酬率、屠宰率和瘦肉率方面有一定优势。

根据以上研究概况，充分利用Hal基因的特点和作用科学指导蒙山特色黑土猪的遗传繁育工作。蒙山黑土猪是一个特色品牌猪种，生长期达10个月以上，采用杂粮、牧草粗饲和山林放养模式饲养，接触外界应激因素很多，筛选具有耐粗饲性、抗应激性的猪群尤为重要。另外，黑土猪市场靶向为特色高端猪肉和品牌猪肉，更注重猪的肉质品性和口感风味，对过快的生长速度、高度的日增重、饲料报酬率和瘦肉率无特殊要求。因此，合理开发利用黑土猪资源的指导方向是：重点培育不表现氟烷敏感的HalNHalN基因型种群，剔除或慎重使用HalNHaln基因型种群及其后代，直接淘汰抗应激能力弱、易产生劣质猪肉的HalnHaln基因型猪只。

3.2 利用商品化PCR-RFLP试剂盒可快速准确诊断不同类型猪种的氟烷基因

当前，氟烷基因型的检测方法主要有：氟烷麻醉法、CK（肌酸激酶）血清水平测定法、血液生化遗传标记辅助测定法、PCR产物测序法、探针检测法及PCR-RFLP法[20]，前3种方法准确性不高，第4、第5种方法用时较长且繁琐。最后一种PCR-RFLP法是根据Hal基因cDNA序列的C1843→T1843突变致使兰尼定受体蛋白的第615位氨基酸发生变异[精氨酸（Arg）→半胱氨酸（Cys）]，而内切酶 HhaⅠ能识别野生型HalN基因的5-GCG↓C-3（即C1843位点）的特点，利用内切酶HhaⅠ快速检测C1843→T1843突变位点来判断猪的应激敏感性[9]。本研究采用北京世纪元亨猪应激基因PCR-RFLP试剂盒检测，选样为猪血液，血液样品DNA纯度高，含量比毛囊更丰富，比剪切耳组织块损伤更小。商品化的试剂盒可靠稳定，本试验中所有不同猪群的样品都能快速检测到清晰的氟烷基因PCR条带及酶切条带，保证了结果的准确性。

3.3 蒙山黑土猪氟烷基因型和等位基因分布状况与分析

地方性陆川猪、国外血统杜洛克和人工驯化野猪是蒙山黑土猪的第1代核心猪种，经PCR-RFLP检测，40头陆川猪、5头杜洛克均为显性纯合子HalNHalN基因型，未携带Haln基因，排除了氟烷隐性等位基因在这些猪群及其后代中对肉质性状的负面影响，也说明地方性陆川猪和引进的杜洛克遗传性能优良，是优秀的杂交母（父）本。15头核心野猪，14头为HalNHalN基因型，1头为杂合子HalNHaln基因型，隐性纯合子为0，说明所有野猪不表现氟烷敏感特性，只携带隐性基因且频率较低（0.033）。对携带隐性基因的野猪，建议剔除，也可以根据需要慎重使用，但在选育时应严格跟踪记录，不能使用携带隐性基因的种猪与其子代交叉繁育。

由HalNHalN基因型核心种猪繁育得到的2代种猪，经随机抽查30头，检测均为HalNHalN基因型。由HalNHalN基因型核心种猪及其2代种猪繁育得到的2~3代商品化黑土猪，经随机抽查10头，检测也全部HalNHalN基因型。结果表明，HalN基因遗传非常稳定，显性纯合子HalNHalN基因型猪之间繁育的后代不会变异产生携带隐性Haln基因的猪群，这为培育无Haln基因的优质型黑土猪奠定了重要遗传学基础。

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抗凝血药可降痴呆症风险

【法新社巴黎10月24日电】今天发表的一项研究报告称，因心脏问题而服用血液稀释剂以预防中风的患者，其罹患痴呆症的风险也显著降低。

研究人员发现，瑞典的444 106名心房颤动（简称房颤）患者在为防止血栓形成而服用药物后，罹患痴呆症的风险降低了29%。房颤是一种可能引发中风的心率异常疾病。

研究人员在《欧洲心脏病学杂志》上发表的报告中说，随着患者继续服药，这种风险还会进一步降低。

这项研究查阅了2006年至2014年瑞典医疗记录中的数据，是有史以来关于房颤患者服用的抗凝血药与痴呆症之间关系的最大规模研究。

科学家们说，抗凝血药与痴呆症之间的密切关系说明血液稀释剂降低了罹患痴呆症的风险，但需要进行临床试验才能确定这一因果关系。

但这里有一个问题。研究报告首席作者、瑞典斯德哥尔摩卡罗琳医学院研究员莱夫·弗里贝里说：“由于伦理方面的原因，此类研究无法进行。不可能给房颤患者服用安慰剂，然后坐等痴呆症或中风出现。”

科学家们此前曾猜测抗凝血药也许可以预防痴呆症，因为它们能够防止微型血栓的形成。微型血栓可能引发不被察觉的微型中风，而后者是导致认知能力下降的一个主要原因。

研究人员找出了瑞典2006年至2014年所有被诊断患有房颤的患者。接下来，他们查看了医生给这些患者开的药，并跟踪了患者的情况。

在最初参与这项研究时，有54%的患者并没有使用口服抗凝血药，比如华法林或阿哌沙班。

研究人员发现，痴呆症的有效预测指标包括：不使用口服抗凝血药、进入老年、帕金森症和酗酒。他们还发现，越早开始使用口服抗凝血药，预防痴呆症的效果就越好。

弗里贝里说，患者应该在确诊后立刻开始服用血液稀释剂并一直坚持服药。他在一份声明中说：“在没有非常充分理由的情况下，医生不应该让患者停止使用口服抗凝血药。”

这项研究发现，传统血液稀释剂华法林与新型口服抗凝血药在预防痴呆症方面的效果没有差异。

（转自 参考消息[N]，2017-10-28）

Detection and Analysis of Halothane Genein Mengshan Black PigandIts Population with Using PCR-RFLP

XIE Lihua1,DAI Guangwen1,LIANG Zhen1,TANG Guochun2,HUANG Shuxin3,4,HUANG Chao1,WU Yinghang1
(1.Wuzhou Center for Animal Disease Control and Prevention,Wuzhou 543002,China;2.Mengshan Center for Animal Disease Control and Prevention,Wuzhou 546700,China;3.Mengshan County Qiangxin Pig Professional Cooperatives,Wuzhou 546700,China;4.Guangxi Mengshan Jinyu Special Agricultural Development Co.,Ltd.,Wuzhou 546700,China)

The genotype of halothane(Hal)gene in Mengshan black pig and its population were analysized by using commercial PCR-RFLP Kit.The core population included Lu Chuan pig,Duroc and the second generation population and commercial pig were homozygous dominant genotype HalNHalN,a wild boar in core population was heterozygous genotype HalNHaln,the whole herd had no homozygous recessive genotype HalnHaln.The allele frequencies Halnin wild boar population and all pigs were 0.033 and 0.005.The result showed that it can be rapid and accurate diagnosis of the different types of halothane gene by using commercial PCR-RFLP Kit,Mengshan black pig and its population does not exhibit halothane-sensitive features,the genetic performance of HalNHalNgenotype pig is stable.

Mengshan black pig;halothane gene;PCR-RFLP

S828.8

A

1002-1957(2017)06-0061-04

2017-11-07

2015年梧州市科学研究与技术开发计划“黑土猪产业化新技术研发与示范”项目（201501025）

谢丽华（1981-），男，广西临桂人，高级兽医师，硕士，主要从事动物传染病学研究工作.E-mail:xielihua123321@sina.com

（编辑：富春妮）