脓毒症导致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的变化及相关性分析

朱 滨* 吴叶顺

（1 苏州大学附属第三医院 重症医学科，江苏 常州 213003；2 苏州大学附属第三医院 心内科，江苏 常州 213003）

脓毒症导致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的变化及相关性分析

朱 滨1* 吴叶顺2

（1 苏州大学附属第三医院 重症医学科，江苏 常州 213003；2 苏州大学附属第三医院 心内科，江苏 常州 213003）

目的 探讨脓毒症导致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的表达及相关性分析。方法 20例脓毒症导致ALI/ARDS患者的外周血在治疗前和治疗后被收集。单核细胞分离后检测TLR4 mRNA水平，ELISA方法检测血清TNF-α和SP-A水平。结果 16例治愈的脓毒症导致ALI/ARDS患者治疗后TNF-α和SP-A水平显著低于治疗前。单核细胞TLR4 mRNA水平、血清TNF-α和SP-A水平相互之间pearson相关分析显示正相关。结论 脓毒症导致ALI/ARDS患者单核细胞TLR4 mRNA水平、血清TNF-α和SP-A水平和病情的急性炎性反应呈正相关。

脓毒症；急性呼吸窘迫综合征；TLR4；TNF-α；SP-A

脓毒症（sepsis）是急诊重症领域极为常见的疾病，脓毒症的定义最近由2.0版变为3.0版。但是其本质是机体对感染的反应失调，导致了呼吸、循环等重要脏器的功能失调，甚至危及生命[1]。急性肺损伤（acute lung injury，ALI）以及柏林指南后统称为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的肺部损伤是脓毒症脏器损伤中最易出现的并发症[2-3]，但是，到目前为止，脓毒症如何从炎性介质释放阶段到导致ALI/ARDS的发生发展，其中机制尚未完全明确[4]。

本文从脓毒症导致ALI/ARDS患者外周血Toll样受体4（Tolllike receptors 4，TLR4）、血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及肺表面活性物质A（surfactant proteins-A，SP-A）水平的变化和相关性分析，来试图阐述脓毒症导致ALI/ARDS的部分机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2015年7月至2017年6月苏州大学附属第三医院（常州市第一人民医院）重症医学科收治的20例符合脓毒症导致ALI/ARDS患者[1-3]，临床治疗方法根据指南包括原发病灶的引流、抗感染治疗、营养支持及补液维持水电平衡等治疗[1-3]。20例患者（男13例，女7例），年龄为（62.1±17.4）岁；治愈16例（男11例，女5例），治愈患者病因分别为肺部感染（4例）、腹腔感染（10例）和皮肤软组织感染（2例）；死亡4例患者（男2例，女2例），病因分别为肺部感染（2例），腹腔感染（2例）。收住入ICU当时抽患者外周血标本2管（治疗前），治疗好转转出ICU或治疗无效患者死亡前抽患者外周血标本2管（治疗后）。第1管行Ficoll淋巴细胞分离液，根据检测说明书分离出单核细胞后予以放置于-80 ℃冰箱保存备用（细胞浓度：1×106）。同时患者抽取的第2管外周血予以放置离心机（3000 r/min）离心10 min后，血清放置入冰箱（-80 ℃）保存。

1.2 方法

1.2.1 试剂：血清TNF-α检测用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（博奥深生物工程有限公司）；血清SP-A检测用ELISA试剂盒（西唐生物制品有限公司）。TLR4引物由上海生工所设计（上游：5'-GCCGGAAAGTTATTGTGGT GGT-3'和下游：5'-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3'）。

1.2.2 检测方法：血清中SP-A/TNF-α的浓度采用ELISA方法检测，操作严格按试剂盒说明进行。TLR4 mRNA检测（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）：按照说明书操作提取总RNA，反转录按照试剂盒说明书操作。

图1 脓毒症导致ALI/ARDS 16例治愈患者治疗前和治疗后外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的变化。a，治疗前和治疗后外周血TLR4水平的变化（#P＞0.05）；b，治疗前和治疗后外周血清TNF-α水平的变化（*P＜0.05）；c，治疗前和治疗后外周血清SP-A水平的变化（*P＜0.05）

图2 脓毒症导致20例ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的相关性分析。a，外周血TLR4与血清TNF-α相关性分析（r=0.65，P＜0.05）；b，外周血TLR4与血清SP-A相关性分析（r=0.56，P＜0.05）；c，血清TNF-α与SP-A 相关性分析（r=0.74，P＜0.05）

1.3 统计学方法：数据分析：PASW Statistics 18.0软件。同组计量资料治疗前后以配对t检验进行统计分析，同一时间点标本不同检测指标用Pearson相关分析，α=0.05作为数据的检验水准，P＜0.05为数据差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 脓毒症导致ALI/ARDS共16例治愈，4例死亡。16例治愈患者治疗前和治疗后外周血TLR4水平差异无统计学意义（图1a，#P＞0.05）；16例治愈患者治疗前和治疗后外周血清TNF-α水平（图1b，*P＜0.05）、SP-A水平（图1c，*P＜0.05）差异有统计学意义。

2.2 脓毒症导致20例ALI/ARDS患者外周血TLR4与血清TNF-α（图2a，r=0.65，P＜0.05）、外周血TLR4与血清SP-A（图2b，r=0.56，P＜0.05）、血清TNF-α与SP-A（图2c，r=0.74，P＜0.05）呈正相关。

3 讨 论

在脓毒症过程中，会有许多感染原发灶产生的诸如脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）的刺激物。LPS进入机体的有效循环血液中与LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP）耦合，形成的复合体再次作用于单核巨噬细胞膜表面的受体CD14分子，LPS/LBP/CD14复合物作用跨膜受体TLR4，产生各级炎性因子，逐级放大致炎作用[5]。因此，脓毒症导致的包括急性呼吸窘迫呼吸综合征或者其他的脏器损伤，病情发展的严重与否与TNF-α等促炎性因子又存在密切的关联[5]。在课题组前期的研究中，发现炎性因子与SP-A也有一定的关联[6]。

本文中的研究结果表明，在治疗好转（治愈组）的16例患者中，治疗前和治疗后的血清TNF-α、SP-A比较差异有统计学意义。这一点也与绝大部分国内的分析结果类似[5-6]，在病情好转后，炎性因子TNF-α，代表肺损伤严重程度的SP-A水平都会显著下降。但是外周血TLR4 mRNA的水平下降后与治疗前却无统计学差异，可能是本研究中的病例数过少导致的。同时研究的另一项不足之处在于，本项研究中脓毒症导致ALI/ARDS的确诊患者数目较少，并且有4例死亡。因此无法作出治愈组和死亡组2组的数据比较和分析。

但是，我们随后作出了所有患者治疗前治疗后外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的相关分析。结果显示这3个指标两两显示为正相关。结果显示随着病情的进展，无论是脓毒症导致的ALI/ARDS病情好转或者死亡，外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的指标上升和下降的趋势是相同的。此项研究的结果也符合课题组前期的研究结果及假说推论[6]，即CD14-TLR4-NF-κB信号传导通路在脓毒症导致的ALI/ARDS过程中，炎性因子（TNF-α等）水平的高低决定了肺脏损伤（SP-A等指标）的严重程度。因此，如何在炎症通路的过程中干预或者药物治疗来减轻脏器损伤的程度，是我们下一步研究的问题。

[1] Djillali A,Eric B,Pierre-Edouard B,et al.Corticosteroids in the Treatment of Severe Sepsis and Septic Shock in Adults:A Systematic Review[J].JAMA,2009,301(22):2362-2375.

[2] Danner RL,Elin RJ,Hosseini JM,et al.Endotoxemia in human septic shock[J].Chest,1991,99(1):169-175.

[3] Fehrenbach H,Brasch F,Uhlig S,et al.Early alterations in intracellular and alveolar surfactant of the rat lung in response to endotoxin[J].Am J Respir Crit Care Med,1998,157(5 Pt 1):1630-1639.

[4] Uhlig S.Ventilation-induced lung injury and mechanotransduction:stretching it too far[J]? Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282(5):L892-896.

[5] Schumann RR,Leong SR,Flaggs GW,et al.Structure and function of lipopolysaccharide binding protein[J].Science,1990,249(4975):1429-1431.

[6] Zhu B,Zheng F,Liu N,et al.Diagnostic Value of Surfactant Protein-A in Severe Acute Pancreatitis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome[J].Med Sci Monit,2014,26(20):1728-1734.

Expression and Correlation Analysis of Toll-like Receptors 4, TNF-α and SP-A in Sepsis Induced ALI/ARDS Patients

ZHU Bin1, WU Ye-shun2
(1 Department of Critical Care Medicine, the Third Aff i liated Hospital of Soochow University, Changzhou 213003, China;2 Department of Cardiology, the Third Aff i liated Hospital of Soochow University, Changzhou 213003, China)

Objective To investigate the expression and correlation analysis of Toll-like receptors 4, TNF-α and SP-A in sepsis induced ALI/ARDS patients. Methods Peripheral blood samples were measured prior to and following treatment in 20 patients with sepsis induced ALI/ARDS patients, in which monocytes were isolated and RT-PCR method was used to detect the expression of TLR4 mRNA.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure serum level of TNF-α and SP-A. Results The post-treatment serum levels of TNF-α and SP-A levels were significantly decreased compared with pre-treatment in the 16 cured cases (P＜0.05). The expression level of TLR4 mRNA on monoeytes and serum levels of TNF-α and SP-A levels observed to be positively correlated with each other in the 20 patients (P＜0.05). Conclusions The expression level of TLR4 mRNA on monoeytes and serum levels of TNF-α and SP-A levels may be associated with acute inflammation in sepsis induced ALI/ARDS patients.

Sepsis; Acute respiratory distress syndrome; Toll-like receptors 4; Tumor necrosis factor-α; Surfactant proteins-A

R459.7

B

1671-8194（2017）31-0001-02

常州市卫生计生委重大科技项目（ZD201505）；江苏省“333工程”科研资助立项项目（BRA2016122）；常州市科技局基金资助（CJ20159022）

*通讯作者：E-mail:icuzb@qq.com