细菌型淡豆豉发酵底物及前酵、后酵工艺研究*

陈丽艳 夏 延 王 萍 张 蕾 孙银玲 王伟明

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 1 5 0 0 3 6）

·方药研究·

细菌型淡豆豉发酵底物及前酵、后酵工艺研究*

陈丽艳 夏 延 王 萍 张 蕾 孙银玲 王伟明**

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 1 5 0 0 3 6）

目的：研究细菌型淡豆豉发酵底物及前酵、后酵工艺。方法：分别以黄豆和黑豆为底物，以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，以4种异黄酮成分的含量为指标考察淡豆豉前酵和后酵工艺。结果：以黄豆和黑豆为底物前酵过程都出现大豆苷和染料木苷的含量下降，大豆苷元和染料木素含量上升的结果，后酵样品中除黄豆后酵组大豆苷元的含量继续升高外，其他异黄酮成分的含量均有不同程度的下降；发酵后黄豆组结合型糖苷含量低于黑豆组，苷元含量则高于黑豆组。结论：从结合型糖苷的降解和苷元的转化角度分析，生产细菌型淡豆豉不需要后酵过程，以黄豆为底物优于黑豆。

淡豆豉 底物 后酵 异黄酮 含量

淡豆豉是以大豆为主料，青蒿、桑叶为辅料经固态发酵制备的传统中药，具有解表、除烦、宣发郁热之功效[1]。淡豆豉传统炮制工艺以黑豆为底物居多[2]，而中国药典（2015年版）规定是成熟大豆的发酵加工品[3]，未明确黑豆还是黄豆，淡豆豉饮片生产企业使用的原料也参差不齐。中国药典中淡豆豉的制备工艺用“黄衣上遍”和“再闷15～20天”来控制发酵过程，并没有考察活性成分或指标性成分的变化，再闷的过程属于后酵过程，其对微生物的生长、代谢以及发酵制品的品质影响很大，也会影响初级或次级代谢产物的成分和含量[4]，从而直接影响药效。另外，药典标准中淡豆豉的生产采用的是多菌种混合自然发酵，存在产品质量不稳定、生产周期长、安全性不可靠等问题[5]，因此无菌条件下纯菌发酵淡豆豉成为必然趋势。目前对于淡豆豉发酵菌种的研究多以细菌和霉菌居多，每类菌生长周期及酶系不同会直接影响淡豆豉的制备工艺和质量。关于细菌型豆豉的研究已有很多报道，采用的菌种为公认的枯草芽孢杆菌，都是以大豆为底物直接接种细菌菌液制成[6-8]，而淡豆豉不同于豆豉，是在发酵过程中添加了青蒿、桑叶作为共同的药性基质，可促进大豆异黄酮苷向苷元的转化，增强了淡豆豉除烦解表功效[9]。

本研究以从市售淡豆豉饮片中分离并经酶活筛选的枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，以黄豆和黑豆为发酵底物，考察前酵和后酵过程对淡豆豉中4种异黄酮类成分含量的影响，为淡豆豉炮制工艺的标准化提供参考。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

DL-CJ-2N型超净工作台；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅；KQ-300DB数控超声波清洗器；Sartorius BSA224S电子天平，DHP-9272恒温培养箱，DK-S24水浴锅，LG10-2.4A离心机，Waters e2695-2489高效液相色谱仪。

1.2 材料

桑叶、青蒿购自河北祁新中药颗粒饮片有限公司，由黑龙江省中医药科学院王伟明研究员分别鉴定为桑Morus alba L.的干燥叶和黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分；黑豆购自哈尔滨北京同仁堂药店，鉴定为豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的干燥成熟种子；黄豆购自哈尔滨北京华联超市。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为D-013-150928、D-016-150423、R-002-150802、R-001-150421。

菌种：分离自淡豆豉饮片（黑龙江德顺长中药饮片有限公司，批号：140701），经中国工业微生物菌种保藏中心鉴定为枯草芽孢杆菌亚种（拉丁名Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2 方法

2.1 淡豆豉样品的制备

2.1.1 接种液的制备 取保存的枯草芽孢杆菌菌种采用划线法接种于营养琼脂试管斜面上，于37℃培养18～24h，加10mL无菌生理盐水将斜面菌落冲洗混匀制成菌悬液，用血球计数板计数，菌液浓度为109CFU/mL，备用。

2.1.2 发酵工艺 参照《中华人民共和国药典》2015年版一部淡豆豉的制备工艺，分别称取黄豆、黑豆各100g（平行3份）,洗净，每份加青蒿、桑叶煎煮液(称取青蒿7g，桑叶10g，加水煎煮2次，每次0.5h，合并滤液，浓缩至120mL)浸泡，中间翻混两次，俟煎煮液充分吸尽，装袋，121℃灭菌40min，放凉，其中黄豆和黑豆组各取2袋，每袋接种2.1.1制备的菌液1mL，摇匀，37℃培养7d（前酵），每种底物样品各取出一份，另一份平行样品转置42℃培养15d（后酵），剩余1袋黄豆和1袋黑豆不接种菌液作为空白样品。

2.2 4种异黄酮成分的含量测定

采用高效液相色谱法测定大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量。

2.2.1 色谱条件[10，11]色谱柱：Waters Symmetry C18 （5 μm, 4.6×150 mm）,甲醇为流动相A，0.5%冰醋酸溶液为流动相B，洗脱程序见表2。流速为1mL/min，检测波长：254 nm，柱温：40℃，进样量 10 μL。

表 1 洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取对照品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，加甲醇制成含大豆苷11.76 μg/mL，染料木苷15.40 μg/mL，大豆苷元16.80 μg/mL，染料木素12.10 μg/mL的混合对照品贮备溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 将2.1.2得到的样品于60℃烘干，粉碎过80目筛，精密称取干粉2g置25 mL容量瓶中，加石油醚超声脱脂，再用80%甲醇溶液超声30 min，放冷，定容至刻度，混匀，以5000 r/min离心10 min，取上清液过0.45μm滤膜用于高效液相色谱分析。

2.2.4 线性关系考察 将混合对照品溶液分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL，按2.2.1的色谱条件测定，分别以进样量（μg）为横坐标，以峰面积(因峰面积较大，故缩小106倍)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程见表2。

表 2 4种异黄酮对照品线性回归方程

结果表明，大豆苷含量在0.024μg～0.164μg，染料木苷含量在0.031μg～0.216μg，大豆苷元含量在0.034μg～0.235μg，染料木素含量在0.024μg～0.169μg内与其峰面积呈良好线性关系。

3 结果

大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量测定结果如表3。与空白组相比，黄豆前酵组大豆苷和染料木苷含量降低了3-5倍，大豆苷元和染料木素的含量分别提高了3倍和1.3倍；黑豆前酵组大豆苷和染料木苷含量均降低了约1.5倍，大豆苷元的含量提高了7.6倍，染料木素含量则有所下降。与前酵相比，后酵样品中除黄豆后酵组大豆苷元的含量继续升高外，其它样品及成分的含量均均有不同程度的下降，其中大豆苷分别下降了13.50%和7.20%，染料木苷分别下降39.46%和30.62%，染料木素分别下降94.89%和71.67%。发酵样品组中黄豆组结合型糖苷含量均低于对应的黑豆组，且苷元含量均高于对应黑豆组。

表3 不同样品4种异黄酮含量测定结果(单位：μg/g)

4 讨论

通过淡豆豉发酵前后异黄酮苷及苷元类成分的含量对比，前酵样品苷类向苷元类成分的转化率较高，这与β-葡萄糖苷酶活性升高密切相关。后酵过程苷类成分含量进一步降低，但不显著，大豆苷元的含量有一定提高，而染料木素含量下降明显，表明大豆苷元在酶的作用下相对比较稳定，而染料木素含量的降低可能是后酵15 d在β-葡萄糖苷酶作用下继续降解为鹰嘴豆芽素或其他异黄酮苷元类物质[12]。与前酵相比，除黄豆后酵组大豆苷元的含量继续升高外，后酵样品其他异黄酮类成分的含量均有不同程度的下降，发酵后黄豆组结合型糖苷含量低于黑豆组，苷元含量则高于黑豆组。由于苷类物质不能被人体直接吸收，需转化为苷元才能被利用，因此，从结合型糖苷的降解和苷元的转化角度分析，生产细菌型淡豆豉不需要后酵过程，以黄豆为底物优于黑豆。

[1] 李刚,龙凯,苏明声,等.淡豆豉炮制至“黄衣上遍”过程中微生物菌群动态变化的初步研究[J].中国实验方剂学杂志,2014,24(11):139-142.

[2] 徐尔雅.淡豆豉的原料应使用黑大豆[J].中药材,1994,17(4):44-46.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:328.

[4] 李刚,梁永红,龙凯,等.再闷过程影响淡豆豉炮制工艺研究[J].中草药,2014,45(8):1083-1088

[5] 潘平平,邱琳,邓开野.曲霉型豆豉多菌种制曲工艺优化的研究[J].中国调味品,2016,41(3):26-31.

[6] 李华，李铎，沈立荣，等. 细菌型豆豉纯种发酵工艺优化[J].中国粮油学报，2009，24（2）：50-54.

[7] 杨胜远,韦锦. 不同豆类细菌型豆豉的功能性成分分析[J].生物技术通报，2014，（2）：166-170.

[8] 吴拥军，贾东旭，王嘉福，等. 豆豉芽孢杆菌前发酵条件初探与酶活力测定[J].食品工业科技，2010，31(9):191-194,333.

[9] 张敏敏，廖丽娜，曹尉尉,等. 在淡豆豉发酵过程中桑叶、青蒿对大豆异黄酮含量的影响[J]. 药学服务与研究，2013，13(2):119-123.

[10] 张敏,吴运莉,印酬,等.“一测多评”法测定淡豆豉药材中4种黄酮类成分[J].中国药学杂志,2014,49(19):1740-1743.

[11] 李刚,梁永红,杨安金,等.淡豆豉不同制法其成品性状及异黄酮类化学成分含量的比较[J].中国药房,2014,25(47):4461-4463.

[12] 葛娟.槐角染料木素裂褶菌转化研究[D].华中科技大学,2011.

国家中医药管理局公益性行业科研专项经费项目（2 0 1 5 0 7 0 0 4-0 3）；哈尔滨市应用技术研究与开发项目（2 0 1 6 R A X Y J 1 0 1）

** 通信作者