大建中汤介导ERK1/2信号通路调控脾阳虚胃癌动物模型MMP-9的表达

贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002

实验研究

大建中汤介导ERK1/2信号通路调控脾阳虚胃癌动物模型MMP-9的表达

何海军王俊霞*杨毅康继红龚小雪

贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002

目的探讨大建中汤对SD大鼠脾阳虚胃癌模型胃癌组织中细胞外调节蛋白激酶1、2(ERK1、ERK2)、基质金属蛋白酶-明胶酶(MMP-9)mRNA的影响。方法将健康SD大鼠随机分为正常组(A)、模型组(B)、大建中汤高、低剂量组(C、D组，给药剂量为生药10.8、5.4 g/kg)、西药对照组(E组，给药剂量为0.019g/kg)。A组予生理盐水，1次/d；B、C、D、E组予番泻叶水浸液灌胃、N -甲基 -N′-硝基 -N -亚硝基胍 (MNNG)储存液自由饮用，并使其饮食失节、疲劳过度复制脾阳虚胃癌动物模型。5个月后，B组予生理盐水，1次/d；C、D组予大建中汤，1次/d；E组予环磷酰胺，1次/d。15d后，处死大鼠。应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法，检测大鼠ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表达量。结果模型组ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表达量明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；大建中汤高、低剂量组、西药组 ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的量明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大建中汤可通过调节ERK1/2信号通路调控MMP-9的表达。

大建中汤；脾阳虚胃癌；ERK1/2信号通络；MMP-9

胃癌(Gastric Cancer)为消化道常见恶性肿瘤，属祖国医学“癥瘕”、“积聚”等范畴，严重影响着人们的生活质量。其形成和瘀血有着密切的关系，而瘀血的产生和人体阳气的功能失常极其相关。由于阳虚则内寒，体内阴寒之邪偏盛则津液精血的运行迟滞，而成为有形之瘀血，最终形成积块。如《灵枢·百病始生》原文所述，“积之始生”，归责于“得寒”和“厥乃成积”。由于脾与胃互为表里，故脾阳虚时，则胃体血管收缩，血行滞涩，极易形成胃部肿瘤。因此，抑制血管收缩成为研究脾阳虚证胃癌的重要靶点。研究拟复制脾阳虚胃癌大鼠模型，探讨脾阳虚证胃癌大鼠癌组织中细胞外调节蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinases 1/2, ERK1/2)、基金金属蛋白酶-明胶酶(MMP-9)的表达及大建中汤的干预作用。

1 仪器与材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，体重(200±20)g，许可证号：SCXK(渝)2007-0006，合格证编号：0000128，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供。

1.2 仪器 匀浆器(德国IKA公司)，Multiskan(r) Go酶标仪(Therm Scientific公司)，Legendmicro 21R高速冷冻离心机(Therm Scientific公司)，PCR仪(美国Bio RAD公司)，Chemi DocTM XRS+ with Image LabTM Software化学发光凝胶成像仪(美国Bio-RAD公司)，DYY-6C型水平电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.3 造模用药 番泻叶(贵阳中医学院第一附医院)。将番泻叶水浸过夜，制成浓度为100%的水浸液(每100mL含生药100g)，同1批药材，按相同条件，每次制备3d药量，4℃冰箱保存待用。N-甲基 -N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG，批号：M0526，北京中顺华腾生物技术有限公司)。

1.4 治疗药物 ①中药汤剂组成及制备：大建中汤药物组成及比例：花椒6g，干姜12g，人参6g，胶饴30g(由贵阳中医学院一附院提供,经贵阳中医学院药学院刘育辰副教授鉴定结果均为正品)。取中药饮片置于玻璃烧杯内，加相当于药材量6倍的冷蒸馏水浸泡1～2 h，煮沸30 min，纱布过滤取汁，二煎加药材量的6倍水，沸腾后煎35 min纱布过滤，合并水煎液，用旋转蒸发仪浓缩为1.08、0.54 g/mL，同1批药材，按相同条件，每次制备3 d药量，4℃冰箱保存待用。②环磷酰胺水溶液(批号: BZQ1482)：按人和动物折算公式把环磷酰胺溶于生理盐水制成含环磷酰胺1.9 mg/mL冷藏备用，同1批药材，按相同条件，每次制备3 d药量。

1.5 检测试剂盒 超纯RNA提取试剂盒(批号：23810G，北京康为世纪科技有限公司)；一步法PCR试剂盒(批号：17613D，北京康为世纪科技有限公司)，引物由上海生工生物科技公司设计合成。

2 方法

2.1 分组与造模 大鼠随机分为5组，正常组(A)、模型组(B)、大建中汤大剂量组(C)、大建中汤小剂量组(D)、西药环磷酰胺组(E)，每组10只。除A组外，B、C、D、E组均参照文献报道[1]的综合造模法复制脾阳虚动物模型，然后再予稀释好的MNNG储存液100 μg/mL置于棕色瓶中，由大鼠自由饮用4个月，1次/d(在此期间不间断给予脾阳虚动物模型造模方法的刺激)，复制脾阳虚胃癌动物模型[2]。模型评判标准：大鼠表现出精神倦怠、纳呆、消瘦，嗜卧，拱背，扎堆，体重、肛温下降、大便溏薄或泄泻，肛周污浊；镜检可见胃粘膜内腺体细胞核大而浓染，核浆比例增大，胃粘膜增厚及结节等表现。

2.2 给药 正常组、模型组生理盐水灌胃，1次/d，持续15 d；大建中汤高、低剂量组灌胃大建中汤(10.8、5.4 g/kg)，1次/d；西药组灌胃环磷酰胺0.019 g/kg，1次/d。

2.3 标本采集和保存 动物连续给药15 d。末次给药后，动物禁食不禁水12 h，股动脉放血，脱颈处死动物，快速开胸摘取胃于平皿中，生理盐水漂去血污，沿大弯侧纵向剖开，置体视显微镜下观察，剪取胃黏膜异常处胃组织两块，液氮冻存，或4%多聚甲醛固定，用于病理检测和PCR实验。

2.4 标本测定

2.4.1 总RNA提取 样品处理：组织：30～50 mg组织充分研磨后加入1 mL buffer RLT；单层培养细胞：吸去培养液，加入适量的buffer RLT，每10 cm2加入1 mL buffer RLT；细胞悬液：离心收集细胞；样品中加入buffer RL后反复吹打几次，使样本充分裂解。置于室温5min，使蛋白核酸复合物彻底分离；以每1 mL buffer RLT加入200 uL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，温室放置2 min；4℃12000 rpm离心10 min，待离心完成后取上层水相，放入新的RNase-Free离心管中；以等体积的比例将70%乙醇(无RNase的水配制)加入得到的上层溶液中，颠倒混匀；将上步所得的溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2mL)的吸附柱(Spin Column RM)中。12000 rpm转速离心20s，弃去收集管内的废液，重新将吸附柱放回收集管内；向吸附柱中加入700uL buffer RW1，12000 rpm离心20 s，弃去收集管内的废液，重新将吸附柱放回收集管内； 向吸附柱中加入500 μL buffer RW2，12000 rpm离心20 s，弃去收集管内的废液，重新将吸附柱放回收集管内；重复1次；12000 rpm离心2 min，去除收集管中的废液，另将吸附柱置于室温数分钟，以达到彻底晾干；将吸附柱置于1个新的无RNase离心管(collection tube 1.5 mL)中，向吸附柱的中间不为键入30～50 uLRNase-Free Water ,室温放置1 min，12000 rpm离心1 min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

2.4.2 一步法RT-PCR 将RNA模版、引物、onestep RT-PCR Buffer、Onestep RT-PCR EnzymeMix和RNsae-Free Water 溶解并置于冰上备用；配置反应体系；震荡混匀，再将溶液短暂离心收集到管底；提前开启热循环仪，设置预热达45℃后，再将PCR管放置于热循环仪内，开始RT-PCR体系反应；反应结束后取5 uL产物，加入适量上样反冲液后进行电泳检测结果。

3 结果

3.1 一般情况 正常对照组体重与实验前相比明显增加，肛温无明显变化，其它亦无明显改变。造模组(模型对照组、大建中汤大剂量组、大建中汤小剂量组、西药对照组)在造模结束后，有不同的精神倦怠、纳呆、消瘦，嗜卧，拱背，扎堆，体重、肛温下降、大便溏薄或泄泻，肛周污浊；镜检可见胃粘膜内腺体细胞核大而浓染，核浆比例增大，胃粘膜增厚及结节等表现，符合脾阳虚胃癌大鼠模型评估标准。

3.2 ERK1、ERK2、MMP-9 mRNA表达检测 由图1、表1可知，模型组ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的表达量高于正常组(P<0.05)；大建中汤高、低剂量组、西药组 ERK1、ERK2、MMP-9mRNA的量明显低于模型组(P<0.05)。提示：大建中汤可通过调节ERK1/2信号通路调控MMP-9的表达。

组别剂量/g/kgERK1/GADPHERK2/GADPHMMP9/GADPH正常组-0.83±0.09△0.85±0.19△0.47±0.58△模型组-1.41±0.35*1.83±0.32*2.41±0.99*大建中汤组(高)10.80.85±0.31△*0.90±0.27△*0.59±0.14△*大建中汤组(低)5.40.96±0.28△*0.94±0.12△*0.70±0.63△*环磷酰胺组0.0190.92±0.42△*0.91±0.25△*0.56±0.35△*

注：与正常组比较,*P<0.05，与模型组比较,△P<0.05。

4 讨论

中医学认为，“阳气”是人体生命活动的物质基础和原动力，人体的气血津液，皆有赖于阳气的温化推动及运化宣畅。阳气充足则气血津液得以正常运行，阳气不足则阴寒内生，终致津液精血的运行迟滞，成为瘀血之邪，最终形成积块。如《灵枢·百病始生》原文提出“积皆成矣”的病理原因在于“温气不行”所造成的“凝血蕴裹而小散”同时伴有“津液灌渗，着而不去”。鉴于脾为中阳，脾之阳气健旺，气血津液流动，加之化生有源，则不易形成积聚，且脾与胃互为表里，因此本项目研究脾阳虚阴寒内盛引起血管收缩对胃部肿瘤产生的影响及大建中汤的干预作用。

ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族成员，与血管收缩和血管平滑肌细胞的增殖有着密切的关系[3]。研究表明[3]，ERK1、ERK2在细胞质可以调节血管平滑肌收缩。活性氧(ROS)作为细胞外和细胞内第二信使可以调节许多下游信号，细胞外ROS的生成可以导致血管平滑肌细胞ERK1/2通路的激活。研究表明，ERK1/2通路的激活对动脉瘤的形成起着重要作用，抑制ERK1/2有可能抑制动脉瘤的形成[4]。MMPs的蛋白水解对血管重建等起着重要作用，其中MMP-9可分解基底膜Ⅳ型胶原，在体内可经一系列蛋白酶级联而激活，激活后形成Ⅳ型胶原酶，降解细胞外基质，破坏基底膜的完整，导致肿瘤细胞向周围组织浸润并侵入血管和淋巴管向远处转移[5]。另外，ROS可以诱导MMP表达，增加肿瘤细胞的侵袭[6]。田氏等[7]研究了不同中医证型胃癌组织中MMP-9的表达情况，结果发现MMP-9在脾胃虚寒型胃癌组织中的含量均高于肝胃不和型及瘀毒内阻型。有研究表明[8]，在MMP-9启动子区存在多种转录因子结合位点，在这些转录因子结合位点之中，其中某些位点可能受ERK调控。

大建中汤有蜀椒、干姜、人参、饴糖组成，具有温阳散寒，补虚缓急之功，是临床治疗脾阳虚寒的常用方剂。唐朋林等[9]观察到寒凝血瘀证荷瘤小鼠使用温阳活血法后，荷瘤小鼠肿瘤转移肺组织中的ERK1/2得到明显下调，从而使肿瘤转移灶生成率降低。杨晓等[10]运用中药健脾消癌方对大肠癌肝转移裸鼠模型进行干预，得出裸鼠模型肝组织中MMP-9、TIMP-1表达量明显下降。从李龙妹等[11]研究证明了扶正抗癌方可以使p-STAT3的蛋白表达水平以及MMP-9蛋白和mRNA的表达水平下调，进一步对PC9细胞的转移产生抑制作用。研究大建中汤对脾阳虚胃癌肿瘤组织ERK1、ERK2、MMP-9mRNA基因表达的影响，结果表明，脾阳虚证胃癌模型大鼠胃癌组织ERK1、ERK2、MMP-9mRNA表达增加，经大建中汤治疗后能明显降低ERK1、ERK2、MMP-9mRNAmRNA的表达，揭示了大建中汤可能通过介导ERK信号通路调控MMP-9的表达发挥对脾阳虚证胃癌的防治作用。但是大建中汤通过介导ERK调控MMP-9发挥作用的途径还需要进一步深入研究。

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DajianzhongRegulateMMP-9ExpressioninModelRatswithDeficiencyofSpleen-yangGastricCancerbyMediateERK1/2SignalPath

HE Haijun WANG Junxia*YANG yi KANG Jihong GONG Xiaoxue

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China

ObjectiveTo study the effect of Dajianzhong decoction on ERK1、ERK2、MMP-9mRNA expression in gastric tissue of rats with spleen-yang deficiency gastric cancer.MethodsFifty SD rats were divided five groups by random,including normol group(A), model group(B),Dajianzhong decoction high-dosage group(C),loe-dosage group(D) and western medicine group(E). The A group were given normal saline. The B、C、D、E were to establish rat model. After five month,the B group were given normal saline,the C、D group were given Dajianzhong decoction(10.8、5.4 g·kg-1) every day, the E group were given western medicine(0.019 g·kg-1)every day. After fiften days, all rats were sacrificed to detect ERK1、ERK2、MMP-9mRNA expression .ResultsThe ERK 1、ERK 2、MMP-9mRNA expression of group B was roser than group A(P<0.05)but in group C、D、E was lower than group B (P<0.05).ConclusionDajianzhong decoction can reinforce the expression of ERK1、ERK2、MMP-9mRNA of rats with spleen-yang deficiency gastric cancer.

Dajianzhong decoction; Deficiency of Spleen-Yang Gastric Cancer;ERK1/2 Signaling Pathway; MMP-9

贵州省科技厅课题(黔科合J字[2012]2084号)；贵阳中医学院博士基金课题。

何海军(1985-)，男， 硕士研究生，研究方向为中医临床基础。E-mail：hehaijun1810sma@163.com

王俊霞(1982-)，女，博士研究生，副教授，研究方向为《金匮要略》方药的实验与临床研究。E-mail:diandian820713@163.com

R285

A

1007-8517(2017)22-0024-04

2017-10-11 编辑：梁志庆)