人参水提取物对羟自由基的抑制作用

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 1166001

人参水提取物对羟自由基的抑制作用

李红艳倪雪娇张旭陈宏伟

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 1166001

目的比较人参不同水溶性提取物对羟自由基(·OH)的抑制作用。方法运用正交试验设计，提取人参水溶性有效部位；采用水杨酸法测定·OH清除率；通过方差分析和样本聚类分析优选·OH抑制剂提取工艺。结果共提取得到16个样品，其中12号样品·OH清除率最大，在1g/L浓度下，其抑制率可达105.08%。结论人参水提取物中含有羟自由基清除剂，其最佳提取工艺为：pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

人参水提取物；正交试验；羟自由基；抗氧化

人参(PanaxginsengC.A.Meyer.)是我国传统中草药，具有抗氧化、增强免疫、神经保护等多种药理作用[1-2]。总结文献发现，人参多种作用都与其抗氧化活性密切相关，有关人参有效成分的抗氧化活性已有多篇报道[3-5]，作者前期也报道了人参的抗氧化作用[2]，并对多种抗氧化酶尤其是人参SOD进行了大量研究。然而，目前报道多是对某种成分进行抗氧化研究，很少进行活性导向下的有效成分分离，对人参中·OH抑制剂的提取分离实验者尤其未见报道。笔者通过正交实验制备不同提取条件下的人参水提取物，并测定其·OH清除率，为探索人参中·OH抑制剂的提取工艺及其活性导向下的有效成分分离奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 生晒参购自阳光大药房，产地为吉林长白山，经本校鉴定教研室张慧教授鉴定，为4～5年生园参；BP-211D电子天平(Sartorius)；ALPHA12冷冻干燥机(Christ)；MR-96A型酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人参水提取物的制备 生晒参，粉碎，平均分成16份，每份0.5 g。按照正交设计助手Ⅱv3.0L16(45)正交设计表，采用缓冲溶液(0.2MNa2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH4.0；0.2MNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH6.0；0.2MNH4Cl-氨水缓冲液，pH8.0、pH10.0)提取，考察的因素水平如下：pH4、6、8、10；料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(m∶v)；提取时间6、12、18、24h；提取温度4、20、40、60℃；提取次数1、2、3、4次。各提取液4℃5000rpm离心10 min，收集上清，合并各次上清液，0.45μM滤膜过滤，各留取1 mL用于实验，标记为1-16号样品，其余液体冷冻干燥后，-20℃保存。

1.2.2 羟自由基清除能力测定 参照文献[6]，采用Fenton法，于96孔板中分别加入FeSO4(6mM)、样品、H2O2(6mM)各20 μL，静置10 min，加入水杨酸溶液(6mM)20 μL，静置30min，测定510 nm处的吸光度A值，以蒸馏水作空白，每个样品3个复孔，计算羟自由基清除率。清除率=A空-(A样-A对)/A空。A空为不加样品的A值，A对为不加水杨酸时的A值。

1.2.3 样本聚类分析 以样品提取率和·OH清除率为聚类要素，运用SPSS13.0软件，对16个样品进行分析，采用离差平方和法(Ward'Method)计算类间距离。

1.2.4 验证性实验 根据羟自由基清除率，优选提取工艺，并按此工艺，重复试验3次，按照上述方法测定并计算提取液羟自由基清除能力(1g/L)，进行验证性实验。

1.2.5 数据统计分析 采用正交设计助手Ⅱv3.0进行数据统计分析，以R值最小列为误差项，进行数据显著性检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参水提取物的制备 利用正交实验，共制备得到16个样品，各样品的提取条件及提取率见表1。

2.2 人参水提物对羟自由基的抑制作用 利用Fenton法测定各样品的·OH清除率，并根据样品浓度及其实验用体积，折算出各样品单位浓度即1g/L(提取物浓度)下的羟自由基清除率(表1)；同时，以·OH清除率(提取物1g/L)为评价指标，对实验结果进行方程分析(表2)。由表1可见，12号和14号样品羟自由基清除率最高且相近；由表2可见，提取温度(D)和料液比(B)对实验结果影响显著(P<0.05)。

表1 人参水提取物的羟自由基清除率

注：A→E五因素的四个水平(1→4)分别为：pH4、6、8、10；料液比(倍)5、10、15、20；提取时间(h)6、12、18、24；提取温度(℃)4、20、40、60；提取次数1、2、3、4次。样品提取率=冻干后样品质量/用于冻干的样品体积×样品总体积/0.5×100%

表2 羟自由基清除率方差分析

2.3 16个样品的聚类分析 为了方便比较各样品间的差距，对16个样品以提取率、·OH清除率(提取物)和·OH清除率(生药)为评价指标进行聚类分析，结果见图1。·OH清除率%(生药，1g/L)等于·OH清除率%(提取物，1g/L)与样品提取率的乘积(结果未列)。由图1可见，当距离为5时，16个样品被聚为2类，即12、14、7聚为一类，其余聚为1类，这与单纯以·OH清除率(提取物)为评价指标的聚类结果(未列)一致。比较各样品的提取条件，不难看出，低温和弱碱性pH是获取较高活性·OH抑制剂的共性条件。

综合图1和表1，12号(A3B4C2D1E3)和14号(A4B2C3D1E4)样品羟自由基清除率最高且相近；同时，据表1直观分析结果，A3与A4、B4与B2、C2与C3接近，考虑到成本的节约和工艺的可行性，最终确定人参水提物中·OH抑制剂的最佳提取条件是A3B2C2D1E3，即pH8，料液比1∶10，4℃提取3次，每次12h。

2.4 验证性实验 按照上述优选的提取方法A3B2C2D1E3，精密称取0.200g生晒参粉，3次浸提液合并，实验平行3份，所得样品羟自由基清除率分别为100.64%、98.25%、94.38%，平均值97.76%，表明该提取工艺下的人参水提取物羟自由基抑制率较高且稳定可行。

3 讨论

前期研究表明，人参中含有多种抗氧化酶[7]，其中人参SOD已被分离得到[8]，其体外活性已有多篇报道[5-7]，对·OH抑制剂的研究目前未见报道。论文参考前期抗氧化酶的提取工艺，考虑到中医的传统用药习惯和人类追求健康饮食的心里，避免使用有机溶剂，采用缓冲溶液提取法制备人参水溶性提取物，并基于正交实验能够较全面地考察多因素多水平，具有实验次数少、方法简便、结果准确可靠等优点。运用正交试验设计优选·OH抑制剂的提取工艺，结果表明，人参水提物中含有·OH抑制剂，其活性受温度、料液比、pH等影响，尤其受温度影响最大，以低温活性较高。根据实验结果，并参考前期研究结果[7]，推测该·OH抑制剂很可能是一种抗氧化酶类，如过氧化氢酶(CAT)。

比较各提取物·OH清除率，以12号样品最高(105.08%)；但比较相同生药浓度(1g/L)下各样品·OH清除率，则4号样品最高(3.11%)。因4号样品的提取率(6.72)是12号样品(1.67)的4倍(表1)，但其·OH清除率(1g/L生药)仅为12号样品的1.8倍(3.11%4号，1.75%12号)，笔者认为，12号样品的提取条件更有利于获得高活性·OH抑制剂。综合实验结果，作者以提取物·OH清除率为评价指标，确定A3B2C2D1E3为最佳提取工艺。当然，本实验仅是对·OH抑制剂提取工艺的初步研究，更为理想的提取方法还需要在此基础上，缩小各水平的跨度做进一步探索。另外，本实验为实验室小试，放大生产后，提取条件可能会发生变化，其活性导向下的有效成分的分离纯化尚需进一步研究。

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InhibitoryEffectofGinsengWaterExtractonHydroxylRadical

LI Hongyan NI Xuejiao ZHANG Xu CHEN Hongwei

College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

ObjectiveComparing the inhibitory effect of different Water-soluble Extracts on Hydroxyl Radical.MethodsUsing orthogonal test design, extraction of ginseng water soluble effective parts; the hydroxyl radical scavenging rate of each extract was determined by salicylic acid method.ResultsSample No. 4 the highest yield (6.72%), Sample No. 12 hydroxyl radical scavenging maximum (105.08%).ConclusionGinseng water extract contains hydroxyl radical scavenger, the optimum extraction process is pH 8, feed ratio 1∶10，extraction 3 times, each time 12h at 4℃.

Ginseng Water Extract; Orthogonal Test; Hydroxyl Radicals; Anti-oxidation

辽宁省教育厅项目(L201606)；中国博士后科学基金项目(2013M530945)。

李红艳(1982-)，女，汉族，博士研究生，副教授，研究方向为中药药理学。E-mail：lhywaiw @163.com

R285.5

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1007-8517(2017)22-0018-03

2017-09-08 编辑：邓佳丽)