正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究

南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300

正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究

涂清波陆冬莺林颖苏鹏亮马宇凡王赛男徐丹*

南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300

目的优选蚓激酶提取工艺参数。方法以赤子爱胜蚓为原料，通过正交试验法，以酶的活性为指标，考察缓冲液pH值、第一次盐析和第二次盐析的饱和度对提取效果的影响，得到蚓激酶粗品经凝胶层析、离子交换层析、透析、超滤等工序制备高活性蚓激酶。结果在缓冲液pH7.5，第一次盐析硫酸胺饱和度为40%，二次饱和度为80%时，蚓激酶比活达3327 u/mg。结论该提取工艺稳定性好，酶活性高。

蚓激酶；提取；工艺优化

蚓激酶又称蚯蚓纤溶酶，1983年由Mihara等[1]首次从蚯蚓中提取分离出来，命名为Earthworm fibrinolytic enzyme(EFE)。2015版药典标准定义为：系人工养殖的赤子爱胜蚓中提取制备的一组蛋白水解酶。目前报道的EFE有几十种，经氨基酸序列测序表明[2-3]，这些酶均具有相似的氨基酸组成，较高的甘氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸含量和较低的赖氨酸含量，与人纤溶酶差异明显。一般认为EFE是丝氨酸蛋白酶，分子量20000～40000、等电点3～5，兼有激酶和纤溶酶两种作用。可直接水解纤维蛋白和凝血因子Ⅰ，选择性激活血块纤溶酶原，抑制血栓素等，具有降低血液黏稠度、减少血小板聚集、改善微循环等作用，临床上用于治疗多种血栓性疾病[4-5]。蚓激酶为第三代溶栓药，具有溶栓作用强、不良反应小、患者易耐受、半衰期长等特点[6-9]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 2-16型冷冻离心机(Sigma公司)；分部收集器(上海沪西分析仪器厂)；DS-1高速组织捣碎机(上海右一仪器有限公司)；冷冻干燥机(上海豫明仪器有限公司)；电子分析天平和pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)。

1.2 材料 赤子爱胜蚓(汇丰蚯蚓养殖基地)；蚓激酶、凝血酶和牛血纤维蛋白原(批号分别为140650-200502、140625-201411、140607-201539，中国药品生物制品鉴定所)；其他试剂为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 酶活测定[10]

2.1.1 标准品溶液的制备 取蚓激酶标准品，加0.9%氯化钠溶液制成浓度分别为1mL中含10000、8000、6000、4000、2000单位的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取供试品适量，加0.9%氯化钠溶液稀释成标准曲线范围内的浓度。

2.1.3 测定法 将已加热的琼脂糖溶液39 mL，纤维蛋白原溶液39 mL和凝血酶3 mL，混匀，倒入直径14 cm的培养皿中，室温放置1 h，打孔进样。每孔加样品10 uL，于37℃恒温放置18 h。测量溶圈的面积。以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，蚓激酶标准品溶圈两垂直直径乘积的对数为纵坐标，计算标准曲线回归方程。将供试品溶圈两垂直直径乘积的对数代入回归方程Y=1.211X+1.566(R2=0.995)，计算供试品效价单位数。

2.1.4 蛋白含量 取本品约20 mg，精密称定，照氮测定法，将结果乘以6.25，即为供试品中蛋白含量，并计算每1 mg供试品中的蛋白毫克数。

比活力公式为：比活力=每1 mg供试品中效价单位数/每1 mg供试品中蛋白的毫克数。

2.2 蚓激酶的提取工艺

2.2.1 工艺流程 新鲜蚯蚓→溶解→匀浆→离心→一次盐析→离心→二次盐析→离心→透析→冻干→蚓激酶粗品。

2.2.2 工艺描述 取新鲜蚯蚓，清水洗净泥土，生理盐水浸泡30 min，捞出用滤纸擦除水分，称重，加1.5倍Tris-HCl缓冲液，匀浆20 min后，10000 r/min冷冻离心，取上清液加硫酸铵，控制一定饱和度，再离心，取上清液再加一定量硫酸铵，静置过夜，离心，收集沉淀，用缓冲液溶解，透析袋(35KD)透析，冻干得到蚓激酶，测定酶活。

2.3 粗酶的单因素考察

2.3.1 缓冲液pH对酶活的影响 文献报道[11]，蚓激酶在pH4～11活力变化很小，pH7.5～8时该酶稳定性最好，活力较高。配制pH6～8之间的Tris-HCl缓冲液，以酶的比活为指标考察缓冲液pH的影响。由图1表明，酶的活性随缓冲液pH呈抛物线变化，当pH为7.5左右时，活性最高。

2.3.2 一次盐析的硫酸铵饱和度对酶活的影响 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。由于一般蛋白质在30%左右的硫酸铵饱和度就开始析出，故选择的饱和度从20%开始，由图2表明，酶的活性随饱和度增大而增大，当达到40%时变化不明显，离心后溶液分层，随着饱和度的继续增加，析出物较多蛋白损失较大，当40%左右时酶活较佳，收率较高。

2.3.3 二次盐析的硫酸铵饱和度对酶活的影响 第二次盐析增加硫酸胺饱和度，考察60%之后对酶活的影响。由图3表明，酶活随饱和度增加呈抛物线变化，当饱和度为80%活性最高，因为饱和度越高蛋白质析出越多，酶活增高，但饱和度过高时杂蛋白也增多，当80%酶活较佳，收率较高。

2.4 正交设计法优化 蚓激酶的提取工艺经单因素试验的条件考察，得出pH为7.5、第一次盐析饱和度为40%、第二次盐析饱和度为80%时酶活较高，因此，分别选取缓冲液pH值(7、7.5，8)、第一次盐析饱和度(30%、40%、50%)和第二次盐析的饱和度(70%、80%、90%)，正交试验设计三因素三水平试验，以酶的活性为指标，优选最佳工艺参数，正交试验结果见表1。

表1 蚓激酶提取工艺正交试验设计

由表1可知，影响因素顺序为pH值>一次盐析饱和度>二次盐析饱和度，最优工艺参数为A2B2C2，即：pH值7.5、一次盐析饱和度40%、二次盐析饱和度80%。

2.5 工艺验证性试验 取最优工艺参数进行3次蚓激酶提取试验，比较酶的活性，结果如表2所示，最优工艺所得的蚓激酶比活平均值为3327U/mg，酶性最高。

表2 工艺验证性试验

3 讨论

蚓激酶是多组分蛋白水解酶，理化性质非常接近，给分离纯化工作带来一定的困难，文献报道的蚓激酶分离纯化由于使用的试验材料和纯化手段的差异，试验结果并不完全一致。本文以赤子爱胜蚓为原料，不同pH下提取蚓激酶，发现pH为6时第一次盐析出现了很多悬浮物，pH为8时第一次析出沉淀很少，而第二次盐析时无沉淀，不溶物全部在溶液上方说明不溶物密度小，尝试不进行分级盐析，而直接进行盐析后10000r/min离心，发现没有沉淀产生。说明部分杂蛋白除去后才能沉淀完全，因此，该蛋白质的提取需要分级盐析。本文以蚓激酶的活性为指标，考察分级盐析法提取工艺的不同条件并对其进行了优化研究。

[1]Mihara H,Sumi H, Akazawa T,et al. fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm[J]. Thromb Haemost,1983,50(2):258.

[2]Nakajima N，Mihara H，Sumi H．Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm，Lumbricus rubellus[J]. Biosci，Biotechn and Biochem，1993，57(10)：1726．

[3]熊焱，杨四成，刘晓英，等．蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定[J]．生物化学杂志，1997，V13(3)：292．

[4]陆琳，徐以南，刘健，等. 注射用蚓激酶临床药效观察[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2007(11):1326.

[5]刘美艳，张双全，张健. 蚯蚓纤溶酶的纯化及pH值、温度和胰蛋白酶对其纤溶活性的影响[J]. 中国生化药物杂志，2003,24(4):167.

[6]李菁华，赵伟. 蚯蚓纤溶酶的分离纯化研究[J].中国生化药物杂志, 2005, 26(5): 288-291.

[7]E Kotb. Biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi[J]. Biotechnology Progress, 2014, 30(3): 656-672.

[8]黄瑛. 蚓激酶及其在心血管疾病中的研究进展[J]. 中国医药指南, 2012, 10(2): 64-65.

[9]吴梧桐. 酶类药物学(1版)[M].北京: 中国医药科技出版社, 2011: 455-459.

[10]李婷,杨骏,张彤.多指标综合评分法优选地龙水提纯化工艺[J].中国新药杂志, 2016(19): 2255-2261.

[11]闫峻，汤立达. 蚓激酶的研究与临床应用[J]. 中草药，2006，37(2):296．

StudyonOptimumPreparationProcessofEarthwormFibrinolyticEnzymebyOrthogonalDesign

TU Qingbo LU Dongying LIN Ying SU Pengliang Ma Yufan WANG Sainan XU Dan*

Nanjing University of Chinese Medicine Hanlin Academy, Taizhou 225300, China

ObjectiveTo select the technological parameters for extracting earthworm fibrinolytic enzyme.MethodsConditions for the extraction were studied by orthogonal design, and the specific activity of earthworm fibrinolytic enzyme were measured. The effects of buffer pH, the first and the second salting out saturation on the extraction efficiency were investigated. Extraction of earthworm fibrinolytic enzyme crude from eisenia foetida, which was purified by gel chromatography, ion exchange chromatography, dialysis, ultrafiltration and other processes to prepare highly active earthworm fibrinolytic enzyme.ResultsThe buffer of pH 7.5, he first saturation of 40% and secondary saturation of 80%, and the highest specific activity of crude was 3327 u/mg.ConclusionThe extraction process is stable and the enzyme activity is high.

Earthworm Fibrinolytic Enzyme; Extraction; Process Optimization

江苏省高等学校自然科学研究面上项目(17KJD350003);泰州市科技支撑计划(社会发展)项目(SSF20170110)；江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201713981004Y)。

涂清波(1984-)，男，汉族，硕士研究生，讲师，研究方向为中药活性成分提取及结构修饰。E-mail:qingbotu@126.com

徐丹(1988-),女，汉族，硕士研究生，讲师，研究方向为中药分析及质量评价。E-mail:xcjdan@163.com

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1007-8517(2017)22-0015-03

2017-09-26 编辑：邓佳丽)