黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其机制

王永清，韩媛媛，韩德兰，林燕，杨晓华

(1张家口学院, 河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院)

黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其机制

王永清1，韩媛媛2，韩德兰1，林燕1，杨晓华1

(1张家口学院, 河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院)

目的探讨黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其可能的机制。方法采用腋下接种Lewis 肺癌细胞悬液的方法制备Lewis肺癌小鼠模型50只，随机分为模型组、顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组，每组10只。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组均给予顺铂2 mg/kg腹腔注射，黄芪多糖低、中、高剂量组同时分别给予黄芪多糖50、100、200 mg/kg腹腔注射，模型组给予等体积生理盐水腹腔注射；1次/周，共3周。各组治疗3周断颈处死，称取肿瘤质量，计算抑瘤率；采用免疫组化法检测肿瘤组织内皮生长因子(VEGF)、内皮抑素(Endostatin)及凋亡基因蛋白Fas、P53表达，采用流式细胞术检测外周血T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+)。结果模型组、顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤质量分别为(1.51±0.46)、(0.52±0.26)、(0.48±0.12)、(0.40±0.02)、(0.29±0.16)g，模型组>顺铂组、黄芪多糖低剂量组>黄芪多糖中剂量组>黄芪多糖高剂量组(P<0.05或<0.01)。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组抑瘤率分别为49.29%、52.13%、57.32%、65.22%。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤组织VEGF表达均低于模型组，Endostatin表达均高于模型组，且黄芪多糖中、高剂量组变化更明显(P均<0.05)。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤组织Fas、P53表达均高于模型组(P均<0.05)，顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。黄芪多糖低、中、高剂量组外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+均高于顺铂组及模型组(P均<0.05)，黄芪多糖低、中、高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈浓度依赖性；抑制VEGF表达、提高Endostatin蛋白表达及免疫功能是其可能的机制。

肺癌；黄芪多糖；顺铂；内皮生长因子；内皮抑素；凋亡基因；小鼠

肺癌是呼吸系统常见恶性疾病，患者预后较差，其发病率及病死率居恶性肿瘤首位[1]。化疗是临床治疗肺癌的主要手段，但不良反应大，患者常难以耐受[2]。顺铂是临床常用化疗药物，可抑制肿瘤细胞DNA的复制过程，有较强的广谱抗癌作用；但其具有明显的细胞毒性，在杀灭肿瘤细胞的同时亦杀灭正常细胞[3]。研究表明，黄芪多糖可强进正常细胞的免疫功能、减少化疗期间不良反应、改善肿瘤患者的生活质量[4]。2016年5～9月，本研究观察了黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用，现报告结果并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：C57BL/6J小鼠50只，雄性，SPF级，8周龄，体质量(20±2)g，由张家口学院动物实验中心提供；自由饮食，饲养湿度36%。细胞：Lewis肺癌细胞株购自美国ATCC公司。主要试剂：顺铂购自云南生物谷灯盏花药业有限公司，黄芪多糖购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，小鼠抗小鼠血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体、内皮抑素(Endostatin)单克隆抗体(一抗)购自英国Abcam公司，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器：紫外可见分光光度计购自北京瑞利分析仪器制造公司，BD FACS Calibur流式细胞仪购自美国Becton公司。

1.2 模型建立与分组处理 从液氮中将Lewis肺癌细胞株取出，放入37 ℃水中融化，14 000 r/min离心5 min，弃上清，加入生理盐水进行稀释，调整细胞密度为1×107个/mL。50只C57BL/6J小鼠适应性喂养1周，取0.2 mL Lewis肺癌细胞悬液接种于C57BL/6J小鼠的右腋皮下，待小鼠肿瘤生长至直径约为5 mm时随机分为模型组、顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组，各10只。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组均给予顺铂2 mg/kg腹腔注射，黄芪多糖低、中、高剂量组同时分别给予黄芪多糖50、100、200 mg/kg腹腔注射，模型组给予等体积生理盐水腹腔注射；1次/周，共3周。

1.3 肿瘤质量及抑瘤率检测 各组治疗3周断颈处死，剥离瘤体，称取肿瘤质量，并计算抑瘤率。抑瘤率=(1-治疗组平均肿瘤质量/模型组平均肿瘤质量)×100%。

1.4 肿瘤组织VEGF、Endostatin表达检测 采用免疫组化法。取部分各组剥离的肿瘤组织，常规石蜡包埋，3 μm厚度切片。将组织切片脱蜡、水化，3% H2O2去离子水孵育10 min，PBS冲洗3次，每次2 min。分别滴加小鼠抗小鼠Endostatin单克隆抗体及小鼠抗小鼠VEGF单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次，每次2 min。滴加聚合物辅助剂(Polymer Helper)，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，每次2 min。滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗、DAB显色。显微镜下观察VEGF、Endostatin表达并拍照，将所得图像输入Image-pro plus6.0软件，目标区选定后计算积分光密度(IOD)值，以此表示肿瘤组织VEGF、Endostatin表达量。

1.5 肿瘤组织凋亡基因蛋白Fas、P53表达检测 采用流式细胞术检测。取部分各组剥离的肿瘤组织，加入生理盐水研磨，PBS洗涤，将细胞数密度调整为1×106～2×106个/mL。检测Fas时加入20 μL CD95-PE后作用1 h，使用流式细胞术进行检测，检测P53时先加入100 μL RNAse及Tren-x100 后作用15 min，再加入(H+L)-FITC 10 μL作用15 min；0.01 mol/L PBS洗涤2次，每次2 min。采用流式细胞仪检测肿瘤组织凋亡基因蛋白Fas、P53表达。

1.6 外周血T细胞亚群检测 采用流式细胞术。各组处死前采用断尾采血法取尾静脉外周血40 μL，加入离心管中(内含6 μL EDTA-2Na)。采用流式细胞仪检测T细胞亚群，计算CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/ CD8+。

2 结果

2.1 各组肿瘤质量及抑瘤率比较 模型组、顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤质量分别为(1.51±0.46)、(0.52±0.26)、(0.48±0.12)、(0.34±0.02)、(0.29±0.16)g；顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤质量均低于模型组(P均<0.01)；黄芪多糖中、高剂量组肿瘤质量均低于顺铂组及黄芪多糖低剂量组，且黄芪多糖高剂量组降低更明显(P均<0.05)。顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组抑瘤率分别为49.29%、52.13%、57.32%、65.22%。

2.2 各组肿瘤组织VEGF、Endostatin及Fas、P53表达比较 见表1。

表1 各组肿瘤组织VEGF、Endostatin及Fas、P53表达比较

注:与模型组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与黄芪多糖低剂量组比较，△P<0.05。

2.3 各组外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比较 见表2。

表2 各组外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比较

注: 与模型组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。

3 讨论

顺铂是肺癌临床常用化疗药物，可抑制肿瘤细胞DNA复制过程，高浓度时对RNA及蛋白质合成抑制作用显著[5]。现代药理学认为，顺铂作用部位主要在DNA的嘧啶碱基及嘌呤基，可损伤癌细胞膜上结构，抑制癌细胞DNA复制过程[6,7]。顺铂的抗癌谱广、作用强，但其细胞毒性导致患者在应用过程中免疫功能受到抑制，进而影响疗效。目前，临床上正积极寻找能够配合顺铂治疗恶性肿瘤的增效减毒药物。黄芪多糖是由传统中药黄芪中提取的有效成分，具有增强并调节机体免疫功能的作用，可作为免疫调节或促进剂，广泛应用于抗肿瘤、病毒、辐射、衰老、应激等方面，且效果较好[8]。本研究结果显示，模型组肿瘤质量>顺铂组、黄芪多糖低剂量组>黄芪多糖中剂量组>黄芪多糖高剂量组，顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组抑瘤率分别为49.29%、52.13%、57.32%、65.22%，呈逐渐升高趋势。说明黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈浓度依赖性。

VEGF是血管渗透性因子，具有促进新生血管形成的作用，其主要的生物学功能是促进血管细胞分裂及增殖，具有明显的促有丝分裂作用[9,10]。本研究结果显示，顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤组织VEGF表达均低于模型组，Endostatin表达均高于模型组，且黄芪多糖中、高剂量组变化更明显；说明黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠抑瘤作用的相关机制可能与其降低VEGF表达、升高Endostatin表达有关。Endostatin是肿瘤衍生的血管生成抑制因子，具有较强的血管生成抑制作用，能抑制原发肿瘤生长、转移[11,12]。Fas、P53是凋亡基因蛋白，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[13,14]。本研究结果显示，顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组肿瘤组织Fas、P53表达均高于模型组，但顺铂组及黄芪多糖低、中、高剂量组比较差异无统计学意义；表明Lewis肺癌小鼠治疗过程中肿瘤组织Fas、P53表达升高为应用顺铂所导致的，与黄芪多糖是否应用关系不大。

随着临床对免疫学研究的不断深入，其在肿瘤治疗过程中的重要性日益受到重视。有研究表明，肿瘤发病的全过程均与宿主免疫状态关系密切，而再肿瘤治疗过程中细胞免疫起重要作用[15]。细胞免疫应答主要是T细胞介导的特异性细胞免疫，外周血CD4+及CD8+亚群正常情况下处于平衡状态，维持机体免疫功能，如该平衡被破坏则机体即出现免疫功能低下，而CD4+/CD8+是反映机体免疫系统平衡的重要指标[16]。本研究结果显示，黄芪多糖低、中、高剂量组外周血CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+均高于顺铂组及模型组，而黄芪多糖低、中、高剂量组比较差异无统计学意义；说明在顺铂治疗的基础上联用黄芪多糖可提高肺癌小鼠的免疫功能，从而增强自身抗肿瘤能力、抑制肿瘤生长。

综上所述，黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用，并呈浓度依赖性；抑制VEGF表达、提高Endostatin蛋白表达及免疫功能是其可能的机制。

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河北省高等教育学会“十二五”高等教育科学研究课题(GJXH2011-41)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.011

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A

1002-266X(2017)44-0039-03

2017-03-09)