羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏微血管损伤的影响及其机制

高芳，厉书林，孙东

(徐州医科大学附属医院，江苏徐州221002)

·基础研究·

羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏微血管损伤的影响及其机制

高芳，厉书林，孙东

(徐州医科大学附属医院，江苏徐州221002)

目的探讨羊水干细胞(AFSCs)移植对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾脏微血管损伤的影响及其可能的机制。方法选择1例孕中期需进行产前筛查的孕妇，穿刺抽取羊水后分离、培养AFSCs，制备AFSCs悬液。将36只小鼠随机分为假手术组、模型组和观察组，每组12只。模型组和观察组采用结扎的方法建立左侧UUO模型，假手术组只游离输尿管不结扎。观察组腹部缝合后经尾静脉注射150 μL AFSCs悬液，模型组和假手术组注射等量生理盐水。三组术后第3、7天分别处死6只小鼠，采用HE染色观察肾组织病理情况，免疫组化法检测肾组织管周毛细血管密度，Western blotting法检测肾组织尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(gp91-phox)、抗硝基酪氨酸(NT)蛋白表达。结果HE染色结果显示：假手术组肾脏结构正常；模型组术后第3、7天出现不同程度的肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，刷状缘消失，肾间质增宽，炎性细胞浸润，肾间质纤维化程度随时间延长而逐渐加重。观察组术后第3、7天均出现肾间质纤维化，但其程度均轻于模型组同时间点。模型组、观察组术后第3、7天肾组织管周毛细血管密度均低于假手术组同时间点，gp91-phox、NT蛋白相对比表达量均高于假手术组同时间点，但模型组变化更明显(P均<0.05)。结论AFSCs移植可减轻单侧UUO小鼠肾脏微血管损伤；通过降低gp91-phox、NT表达而减轻氧化应激是其可能的机制。

输尿管梗阻；羊水干细胞；微血管损伤；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶；抗硝基酪氨酸

干细胞是一类具有较强自我更新和定向分化能力的原始细胞，是组织、器官结构与功能再生的理想种子细胞，因此干细胞移植逐渐成为肾脏疾病修复再生的治疗手段[1～3]。胚胎干细胞(ESCs)是一类未分化细胞，具有高度的自我复制能力，几乎可以分化为人体内所有的组织器官，但因伦理学争议及安全性问题导致其应用受到限制[4]。羊水干细胞(AFSCs)是比成体干细胞(ASCs)更原始的干细胞，其多能性介于ESCs和ASCs之间，可以向脂肪细胞、成骨细胞、神经原细胞等分化。维持肾脏微血管的数目及功能，对于减轻肾脏组织形态学损伤及肾功能恶化、延缓肾脏纤维化进程具有重要意义。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(gp91-phox)与硝基酪氨酸(NT)均为氧化应激相关因子，其表达变化均可引起氧化应激及炎症反应。2014年12月～2016年2月，本研究观察了AFSCs移植对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾脏微血管损伤的影响。现将结果及其可能的机制报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性裸小鼠36只，6～8周龄，体质量18～22 g，由徐州医学院实验动物中心提供，实验期间小鼠自由饮水、摄食，饲料由徐州医学院实验动物中心提供。主要试剂：DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、FBS均购于美国Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液均购于上海碧云天生物技术研究所，抗gp91-phox兔多克隆抗体购于美国Abcam公司，抗NT鼠多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 AFSCs分离及培养 选择1例孕中期需进行产前筛查的孕妇，穿刺抽取羊水10 mL，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，下层沉淀即为AFSCs。将AFSCs使用DMEM/F12培养基进行培养，并加入15% FBS、4 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 μg/mL谷氨酰胺、1%双抗。将细胞悬液接种于25 cm2培养瓶中，加入5 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO2温箱中进行培养。待细胞融合至70%～80%后，加入0.05%酶-EDTA进行消化，按1∶3进行传代培养，2～3天更换培养基。本研究通过医院伦理委员会审核，孕妇及其家属均知情同意。

1.3 建模与分组处理 将36只雄性昆明小鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组和观察组，每组12只。模型组和观察组采用结扎的方法[5]建立左侧UUO模型；假手术组只游离输尿管，不结扎。观察组腹部缝合后经尾静脉注射150 μL AFSCs悬液(AFSCs数量为3.5×105个)，模型组和假手术组注射等量生理盐水。三组于术后第3、7天分别处死6只小鼠，打开腹腔后迅速切除左肾，剥离肾包膜，冷生理盐水冲洗干净。取部分肾组织置于10%中性甲醛中固定，剩余肾组织-80 ℃保存备用。

1.4 相关指标观察

1.4.1 肾组织病理情况 采用HE染色。取三组术后第3、7天中性甲醛固定后的肾组织标本，石蜡包埋，4 μm厚度切片。贴附于防脱载玻片上，60 ℃烤箱烘烤3 h。常规脱蜡至水，苏木素染色，蒸馏水冲洗；待达到合适的染色程度，置于0.25%盐酸乙醇中分化数秒，蒸馏水冲洗。1%氨水返蓝，蒸馏水冲洗3次，于伊红染液中浸染数十秒；显微镜下观察染色程度，蒸馏水冲洗3 min×3次。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。400倍光学显微镜下观察肾组织病理改变。

1.4.2 肾组织管周毛细血管(PTCs)密度 采用免疫组化法。取三组术后第3、7天中性甲醛固定后的肾组织标本，石蜡包埋，4 μm厚度切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，PBS清洗5 min×3次。枸橼酸盐缓冲液高压水煮抗原修复，PBS清洗5 min×3次，3% H2O2孵育，消除内源性过氧化物酶，PBS清洗5 min×3次。进口羊血清工作液37 ℃ 封闭1 h，PBS浸洗5 min×3次。加入CD34一抗，4 ℃孵育过夜，室温复温30 min，PBS清洗5 min×3次；加入二抗，室温孵育至少1 h。PBS摇床清洗5 min×3次。显微镜下DAB液显色，苏木素复染，1%盐酸分化，脱水，透明，封片。400倍光学显微镜下观察CD34表达情况，CD34阳性表达呈黄褐色，定位于肾脏间质。采用Image Pro Plus软件分析其光密度值，以CD34表达的光密度值表示肾组织PTCs密度。

1.4.3 肾组织gp91-phox、NT蛋白表达 采用Western blotting法。取置于-80 ℃保存的肾脏组织，加入裂解液，冰浴中匀浆，4 ℃条件下以12 000 r/min离心15 min，所得上清即为组织蛋白提取液。采用BCA法，以牛血清白蛋白为标准品测得蛋白浓度。各组取配平后蛋白100 μg/10 μL于10%变性聚丙烯酰胺凝胶上，电泳后采用半干电转移的方法将蛋白转移至PVDF 膜上，置于封闭液(3% BSA)中室温下封闭2 h。加入一抗(gp91phox稀释倍数为1∶800，NT稀释倍数为1∶200，内参β-actin稀释倍数为1∶1 000)，4 ℃过夜后常温下复温30 min，washing buffer洗涤5 min×3次；加入二抗室温下孵育2 h，washing buffer洗涤5 min×3次。采用BCIP/NBT磷酸酶显色试剂盒进行显色，扫描仪分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)条带灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 三组肾组织病理情况比较 假手术组肾脏结构正常；模型组术后第3、7天出现不同程度的肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，刷状缘消失，肾间质增宽，炎症细胞浸润，肾间质纤维化程度随时间延长而逐渐加重。观察组术后第3、7天均出现肾间质纤维化，但其程度均轻于同时间点模型组。

2.2 三组肾组织PTCs密度比较 见表1。

表1 三组肾组织PTCs密度比较

注：与假手术组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间点比较，#P<0.05。

2.3 三组肾组织gp91-phox、NT蛋白表达比较 见表2。

表2 三组肾组织gp91-phox、NT蛋白相对表达量比较

注：与假手术组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间点比较，#P<0.05。

3 讨论

肾间质纤维化与肾功能恶化密切相关，是各种慢性肾脏病长期迁延、最终进展到慢性肾衰竭的共同途径和主要病理基础[5]。近年来研究发现，肾脏微血管损伤对肾间质纤维化的进展具有不容忽视的作用[6]。在梗阻性肾病的发病过程中，肾脏组织血供减少，肾小管上皮细胞发生缺血缺氧性坏死和细胞凋亡；同时PTCs血流量减少，氧分压降低，引起氧化应激反应，使活性氧(ROS)生成增加。ROS除可引起大分子(主要为脂质、蛋白质和DNA)氧化损伤外，还可促使PTCs损伤，肾实质细胞转化为纤维母细胞，使细胞外基质沉积增加，间质纤维化程度加重，从而在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用[7,8]。PTCs损伤、丢失又可进一步导致局部组织缺血缺氧，引起氧化应激反应。由此可见，PTCs损伤、局部组织缺血缺氧在慢性肾脏病的进展中形成恶性循环，最终加快肾脏纤维化的进程[9,10]。

目前基因治疗和干细胞治疗的联合应用已经成为再生医学中的研究热点。AFSCs因具有比其他干细胞更多的优势而被广泛应用于基因治疗中，其优势包括来源容易、具有多向分化潜能、易被外源基因转染、表达稳定、低风险(抗免疫排斥和癌症)、不受伦理限制等，被认为是最具潜力的基因治疗方法之一。AFSCs具有分化为内、中、外3个胚层的潜能，并且表面能表达ESCs和ASCs表面标记物Oct-4[11～13]。PTCs是对维持肾小管正常形态结构、功能以及肾小球滤过功能起关键作用的微血管网。PTCs损伤可导致肾间质缺血、缺氧，进而加重纤维化。CD34抗原主要表达在毛细血管、小血管内皮细胞质中，能够反映PTCs密度，是血管内皮细胞的可靠标志物。本研究结果显示，模型组和观察组肾组织CD34光密度值均低于假手术组，并出现肾间质纤维化，但模型组变化更明显；表明AFSCs移植有助于增加单侧UUO小鼠的肾脏微血管密度，修复受损肾脏微血管内皮，进而增加肾脏肾小管间质微循环，改善组织缺血缺氧的状态，从而减轻肾间质纤维化。

综上所述，AFSCs移植可减轻UUO小鼠肾脏微血管损伤；通过降低gp91-phox、NT表达而减轻氧化应激可能是其作用机制。

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国家自然科学基金资助项目(81270769)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20161172)；江苏省“十二五”医学重点人才项目(RC2011116)；江苏省六大人才高峰项目(2010-WS043)。

孙东(E-mail： sundong126@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.008

R693.2

A

1002-266X(2017)44-0029-03

2016-09-14)