汉防己甲素对胶质瘤细胞的抑制作用

鄂 震 高国栋

(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710000)

汉防己甲素对胶质瘤细胞的抑制作用

鄂 震 高国栋

(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710000)

目的探讨汉防己甲素(Tet)对胶质瘤的作用及其机制。方法MTT实验与接种肿瘤鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测Tet对U87人胶质瘤细胞增殖的影响；流式分析汉防己甲素对U87人胶质瘤细胞凋亡、周期的影响；苏木素-伊红(HE)染色分析汉防己甲素对血管新生的影响；免疫组织化学实验检测Tet对增殖细胞核抗原(PCNA)与信号传导及转录激活因子(p-STAT3)分布表达影响；Western印迹实验分析Tet对U87人胶质瘤细胞STAT3蛋白及与凋亡相关蛋白表达的影响。结果增殖细胞核抗原能够抑制U87人胶质瘤细胞增殖，呈时间、剂量依赖性；Tet能够诱导U87细胞凋亡呈剂量依赖性；Tet抑制血管新生；Western印迹结果表明Tet降低STAT3磷酸化，STAT3下游基因包括Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA在Tet处理之后表达减少；PARP、caspase-3、酶切caspase-9蛋白表达增加，促凋亡蛋白Bax表达上调。结论Tet抑制胶质瘤细胞增殖，诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制血管新生可能与降低STAT3磷酸化有关。

汉防己甲素；胶质瘤;STAT3

胶质瘤是常见的脑部肿瘤〔1〕。外壳手术是治疗胶质瘤的第一选择。但不能完全切除胶质瘤；常见的化学治疗包括卡莫司汀和替莫唑胺等。由于肿瘤耐药性及反复发作化学治疗仅能够将存活时间提高到14个月〔2〕。汉防己甲素(Tet)是从防己(Moore)根部提取的双苄基异喹啉类生物碱。Tet通过活性氧(ROS)调控的线粒体通路诱导肿瘤细胞凋亡，促进线粒体色素C释放，切割PARP并且减少Bcl-XL水平〔3〕。信号转导及转录激活(STAT)3作为一种转录因子而被发现，被细胞因子和生长因子激活〔4〕。有些抗肿瘤药物例如隐丹参酮和5-氟尿嘧啶等通过使STAT3失活抑制肿瘤生长〔5〕。本文探究Tet是否能够通过STAT3信号通路抑制胶质瘤。

1 材料与方法

1.1主要试剂 Tet购自Sigma-Aldrich公司。U87细胞购自中国科学院。DMEM培养基购自Gibco Life Technologies公司。PARP、caspase-3、酶切caspase-9、caspase-8、 Bax、Bcl-2、增殖细胞核抗原(PCNA)、CyclinD1、信号传导及转录激活因子(STAT3)、phospho-STAT3和HIF-α抗体购自Cell Signalling Technology公司，GAPDH购自Santa公司。

1.2细胞和胚胎培养 U87人胶质瘤细胞(中国科学院)在含有10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Invitrogen，美国)DMEM(Gibco Life Technologies,Paisley,Scotland,UK)培养基中培养。培养条件为5% CO2及37℃人为环境中。鸡胚孵育在人工孵育器中。

1.3噻唑兰(MTT)实验 将细胞接种于96孔板中，细胞密度3×103个，并且设置4个副孔。接种24 h后，分两组处理。第一组用不同浓度Tet(0、3.2、7.5、15、30和60 μg/ml)或白细胞介素(IL)-6处理U-87细胞48 h。第二组用15 μg/ml Tet处理U-87MG细胞24、48、72 h。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，每孔U-87细胞中加入20 μl的5 mg/ml MTT试剂，放在细胞培养箱中培养4 h。丢弃MTT溶液，加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，然后在摇床上摇荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm处检测吸光度值。

1.4胶质瘤模型建立 在鸡胚形成第9天，将鸡胚随机分组，且将小塑料环放在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)。将细胞重悬于DMEM培养基，分别用不同浓度Tet(0、4、8 mg/ml)处理细胞，之后注射到CAM上的环。然后用透明胶带包住受精卵。每天在体式显微镜下观察。胚胎形成14 d，用4%多聚甲醛固定，拍照。在低温下处死鸡胚。肿瘤体积(V)=4/3πr3。

1.5苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学 根据标准流程进行HE染色。对于免疫组化染色，先将石蜡包被的切片在65℃放置1～1.5 h，二甲苯中脱蜡，然后在不同浓度的乙醇脱水。过氧化氢孵育10 min。枸橼酸钠缓冲液(10 mmol/L，pH6.0)，淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3 min后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲，以助冷却)。正常血清封闭60 min。用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，包括PCNA和p-STAT3，置于4℃冰箱过夜。PBS洗5 min，2次。滴加生物素化的二抗，37℃，40 min。PBS洗5 min，2次。滴加链霉亲合素生物素抗体复合物(SABC)复合物，37℃，40 min。PBS洗5 min，2次。二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止)。

1.6Western印迹实验 将U87细胞中培养基弃掉，用PBS洗两次。每个小皿加入80 μl裂解液，在冰上裂解20 min。刮蛋白，4℃,13 000 r/min离心13 min，收集总蛋白裂解液。二喹啉甲酸(BCA)工作液根据牛血清白蛋白(BSA，0.5 mg/ml)制备标准曲线，检测不同处理细胞蛋白浓度，制备上样蛋白。等量蛋白总量在8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中分离。之后电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶在室温封闭1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育PARP,caspase-3、酶切caspase-9、caspase-8、Bax、Bcl-2、PCNA、CyclinD1、STAT3,p-STAT3(Tyr705)、HIF-α、VEGFA和GAPDH，放在4℃，过夜。PBS洗3次，每次5 min。孵育相应的二抗。PBS洗3次，每次10 min。在膜上均匀撒化学增湿发光法(ECL)发光液在化学发光成像系统中显影。

1.7CAM血管新生实验 在鸡胚形成第9天，将塑料环放置在CAM上，随机分组。60 μl的(0、4、8 mg/ml)Tet滴在塑料环中央，每天滴加。在第12天，CAM样品在4%多聚甲醛固定30 min。低温处死鸡胚之后，在体式显微镜下观察。

1.8凋亡检测 Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒根据生产商使用说明检测细胞凋亡，然后用流式分析。U87细胞接种于六孔板中，接种密度为0.5×105个，分为两组，一组为对照组，不同浓度Tet处理细胞24 h。之后PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化细胞，4℃,1 000 r/min离心5 min。细胞重悬于200 μl PBS中。再次离心，重悬于500 μl 1×Annexin结合缓冲液。然后将100 μl细胞与5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶在室温下孵育15 min。之后用FACScan流式分析仪分析细胞凋亡情况。

1.9统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差，GraphPad Prism5.0进行统计作图。

2 结 果

2.1Tet抑制胶质瘤生长 MTT实验表明Tet能够抑制U87细胞增殖，与对照组(0 μg/ml组)相比〔(93.4±2.5)%〕，不同浓度Tet组的细胞存活率显著降低〔3.2、7.5、30.0、60.0 μg/ml Tet组存活率分别为(87.6±2.1)%、(76.5±4.3)%，(56.7±2.2)%，(43.7±1.8)%，(38.9±1.4)%，Plt;0.05〕，且对U87细胞抑制作用呈时间、剂量依赖性。15 μg/ml Tet处理24、48、72 h，U87细胞存活率分别为(73.6±2.6)%、(58.4±2.4)%，(38.7±1.8)%。不同浓度Tet注射CAM之后第1天，三组肿瘤大小没有明显差异；处理之后第3和第5天，对照组(0 μg/ml组)肿瘤明显大于处理组；4 mg/ml Tet处理CAM 5 d后，肿瘤体积为(305.5±63.2)mm3，8 mg/ml Tet处理CAM 5 d后为(131.81±40.4)mm3，对照组(0 mg/ml组)为(2 323.31±131.5)mm3，Tet处理之后肿瘤体积显著低于对照组(Plt;0.01)。见图1。

2.2Tet诱导U87胶质瘤细胞凋亡 Tet能够诱导U87细胞凋亡，并且呈梯度依赖性〔0.3、3.25、7.5、15.0、30.0、60.0 μg/ml Tet组凋亡率分别为(4.5±0.8)%、(12.4±1.2)%、(20.7±1.3)%、(35.4±1.2)%、(55.2±1.4)%、(72.5±1.2)%〕(Plt;0.01)。30 μg/ml Tet处理U87细胞24 h后，细胞凋亡率达到52.75%。Tet处理后U87细胞在G0/G1期分布显著增加，S期显著减少，见图2A(Plt;0.01)。Western印迹结果表明不同浓度Tet处理U87细胞24 h后，PARP、caspase-3、酶切caspase-9蛋白表达增加，而caspase-8没有明显差异，Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax表达上调，Tet处理之后抑制PCNA表达(图2B；Plt;0.05)。免疫组织化学结果表明，不同浓度(0、4、8 mg/ml)Tet处理后抑制移植瘤中PCNA表达〔PCNA阳性分别为(88.7±2.7)%；(20.2±2.9)%，(18.7±3.1)%〕(图2C，Plt;0.01)。

2.3Tet抑制血管新生 图3A显示移植瘤周围脉管系统，8 mg/ml Tet显著降低血管面积与CAM面积比值(VA/CAM%)〔28.7±1.1)%〕，与对照组(0 mg/ml)〔(40.6±2.3)%〕有统计学差异(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet组VA/CAM为(40.9±4.1)%。图3B显示8 mg/ml Tet处理后CAM血管新生明显少于对照组(0 mg/ml)；4 mg/ml Tet组为(22.4±11.7)%，8 mg/ml Tet显著降低血管新生面积与CAM面积比值(VA/CAM%)〔(19.5±5.7)%〕，与对照组(0 mg/ml)〔(33.8±10.4)%〕有统计学差异(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet组(22.4±11.7)%。8 mg/ml Tet处理之后显著降低微小血管密度〔(0.9±0.2)N/mm2〕与对照组(0 mg/ml)〔(4.5±0.4)N/mm2〕相比差异显著(Plt;0.05)；4 mg/ml Tet组为(3.5±0.4)N/mm2。见图3C。

图1 Tet对U87人胶质瘤细胞增殖影响

与0 μg/ml Tet比较：1)Plt;0.01，2)Plt;0.05图2 汉防己甲素对U87细胞凋亡影响

2.4Tet对p-STAT3及其下游蛋白表达影响 Western印迹结果表明3.2、15.0、30.0 μg/ml Tet处理U87细胞后STAT3磷酸化(0.76±0.05，0.48±0.03，0.25±0.06)显著少于对照组(0 mg/ml)(0.91±0.05，Plt;0.05)。STAT3下游基因包括Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA在Tet处理之后表达减少(Plt;0.05)，见图4A，4B。在对照组中，p-STAT3在移植胶质瘤中的分布广泛〔(39.7±3.4)%〕，与此同时，4 mg/ml和8 mg/ml Tet处理移植瘤之后降低p-STAT3表达〔(10.1±1.6)%，(5.1±0.8)%；Plt;0.01〕。见图4C。

图3 汉防己甲素对血管生成的影响

A、B：不同浓度Tet(0、3.2、15和30 μg/ml)处理U87细胞之后对p-STAT3，t-STAT3,Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA蛋白表达影响；C：免疫组织化学染色检测p-STAT3表达图4 汉防己甲素对p-STAT3以及下游蛋白表达的影响

3 讨 论

鸡胚CAM实验是一种肿瘤移植模型实验，本研究结果提示，汉防已甲素能够在体内体外抑制人胶质瘤细胞生长。已有报道表明Tet能够诱导在人膀胱癌细胞与胸腺癌细胞中线粒体调节的凋亡〔6〕。Tet能够明显促进PARP总蛋白、PARP切割、caspase-3、酶切caspase-9和Bax蛋白表达，而不影响caspase-8表达，Tet可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。已有报道表明Tet能够抑制肿瘤细胞增殖从而发挥抗肿瘤作用〔7〕。但Tet抑制肿瘤细胞增殖是在G0/G1期阻滞细胞还是G2/M期阻滞细胞存在争议。本文发现Tet抑制神经胶质瘤是通过使细胞阻滞于G0/G1期。在CAM中充足的血液供养胶质瘤移植瘤生长〔8〕。本研究结果说明Tet抑制胶质瘤部分作用是通过抑制血管新生。有报道显示细胞活性、增殖和血管新生是依赖于p-STAT3表达〔9〕。STAT3在恶性肿瘤中扮演重要角色，例如肝癌、结肠癌和前列腺癌及胶质瘤〔10～13〕。本研究结果表明U87细胞中p-STAT3和它的下游蛋白(Bcl-2,CyclinD1,HIF-α和VEGFA) 在Tet处理之后表达降低，并且呈剂量依赖性。

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〔2017-04-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)22-5568-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.036

高国栋(1954-)，男，博士，主任医师，主要从事帕金森病、脑胶质瘤研究。

鄂 震(1990-)，男，博士，住院医师，主要从事脑胶质瘤研究。