高效液相色谱法测定丙戊酸镁血药浓度的方法改进及质控评价

杨颖达，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西医结合医院药学部，湖北 武汉 430000）

高效液相色谱法测定丙戊酸镁血药浓度的方法改进及质控评价

杨颖达，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西医结合医院药学部，湖北 武汉 430000）

目的 改进测定人血清中丙戊酸镁浓度的高效液相色谱法。方法 血清样品经1.0 mol／L硫酸沉淀，以环己甲酸为内标，以2－溴 －4′－硝基苯乙酮为衍生试剂。采用高效液相色谱法测定，色谱柱为Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，10 m），流动相为甲醇－水（81∶19），检测波长为265 nm，流速为1.0 mL／min，柱温为25℃。并对 2016年度医院216份质控样本进行统计分析。结果 内标和丙戊酸镁衍生物的保留时间分别为 4.1 min 和 5.4 min，质量浓度线性范围为 11.0 ～200.0 g／mL（r＝0.999 3），平均回收率为 98.2% ～102.5%，批内、批间精密度 RSD＜2.3%，稳定性试验 RSD＜3.9%，2016年度质控数据批间 RSD＜15%，符合2015年版《中国药典(四部)》要求。2016年度质控基本符合正态分布，所有质控数据均为在控。结论 改进后的方法简便、快速、准确，适用于临床丙戊酸镁血药浓度监测，室内质控评价保证了血药浓度监测质量。

丙戊酸镁；高效液相色谱法；血药浓度监测；质控评价

丙戊酸镁（magnesium valproate）是继丙戊酸钠后的临床一线抗癫痫药[1]。近年来，用于治疗偏头痛[2－3]、精神分裂症攻击行为[4－5]、脑卒中后抑郁[6]等，疗效较好。由于该药在使用过程中存在恶心、呕吐、嗜睡、皮疹、水肿等不良反应[7－8]，合并用药的慢性病患者较多[3，9]，有使用不当引起的中毒报告[10]。依据其疗效和不良反应发生率与血药浓度有一定的相关性[1]，定期动态监测其血药浓度是其应用安全有效的保障。目前，已报道的质量浓度测定方法主要有色谱分析法，包括气相色谱[11－12]和液相色谱[13－14]。本研究中在单位实验室现有条件下，参考文献[13]，改进并建立了测定患者血清丙戊酸镁浓度的高效液相色谱（HPLC）法，并对2016年测定的质量控制进行了评价，准确性和稳定性较好，可为临床合理用药提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（Waters 2998光电二极管阵列检测器，Empower 3工作站，美国Waters公司）；Discovery DV215CD型电子分析天平（美国奥豪斯公司）；XH－CX型漩涡混合器（金坛市白塔新宝仪器厂）；NW－10UV型超纯水机（郑州南北仪器设备有限公司）；SC－2556型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2 试药

丙戊酸镁标准品（中国食品药品检定研究院，批号为 101151－201001）；环己甲酸（梯希爱＜上海＞化成工业发展有限公司）；2－溴－4′－硝基苯乙酮（上海弘顺生物科技有限公司）；甲醇（美国天地有限公司），其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂上海有限公司）；空白血清（湖北省中西医结合医院检验科提供）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18柱（200 mm × 4.6 mm，10 μm）；流动相：甲醇 －水（81 ∶19）；检测波长：265 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：25 ℃ ；进样量：10 μL。定量分析：内标峰面积定量计算。

2.2 溶液制备

丙戊酸镁标准品血清及质控血清：称取丙戊酸镁标准品11.0 mg，精密称定，用甲醇定容至100 mL，配制成质量浓度为110.0 μg／mL的贮备液，精密吸取系列体积溶液，置5 mL离心管中，氮吹仪吹干甲醇，置4℃冰箱中贮存备用。待测定时向离心管中分别加入200 μL空白血清，制成系列质量浓度标准品血清及质控血清。

内标标准液：称取环己甲酸5 mg，精密称定，用正己烷定容至100 mL，配制成质量浓度为50 g／L的内标溶液。

衍生化试剂：称取2－溴－4′－硝基苯乙酮5.0 mg，精密称定，用乙腈定容至10 mL，配制质量浓度为0.5 g／L的溶液。

三乙胺乙腈液：精密吸取三乙胺0.2 mL，用乙腈稀释至100 mL，即得。

以上所有配制溶液均置4℃冰箱保存备用。

2.3 血清样品处理

取离心后的样品血清 200 μL，加 1.0 mol／L 硫酸200 μL酸化，用500 μL环己甲酸正己烷内标液萃取离心，取上层有机相 200 μL，加三乙胺乙腈液 200 μL碱化，加衍生化试剂 50 μL，密置，50 ℃水浴 20 min，氮气吹干，用100 μL甲醇溶解残渣，取10 μL进样测定。

2.4 方法学考察

分离度与专属性试验：按拟订色谱条件测定，结果环己甲酸和丙戊酸镁衍生物保留时间分别为4.1 min和 5.4 min，与血浆中的其他成分色谱峰分离度超过1.5，各成分基线分离良好，无干扰，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线和最低检测限确定：取 11.0，22.0，44.0，66.0，132.0，200.0 μg ／mL 系列质量浓度丙戊酸镁标准品血清，按2.3项下方法处理并测定，以丙戊酸镁衍生物峰面积与内标衍生物峰面积之比(Y)为纵坐标，以标准品血清质量浓度(C，μg／mL)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝0.008 7 C ＋0.040 8， r＝0.999 3(n＝6)。结果表明，丙戊酸镁质量浓度线性范围为11.0 ～200.0 μg／mL，血清中最低检测限为 11.0 μg／mL，最小定量限为 4 μg／mL（S ／N≥3）。

回收率及精密度试验：取含丙戊酸镁标准品低、中、高 3 个质量浓度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的质控血清，按2.3项下方法处理，分别于1 d内和连续3 d内测定丙戊酸镁浓度，计算批内及批间的回收率，批内及批间的精密度。结果见表1。

表1 回收率和精密度试验结果(n＝5，%)

稳定性试验：取含丙戊酸镁标准品低、中、高3个质量浓度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的质控血清各 2 mL，室温放置，分别于0，4，21 h时测定丙戊酸镁的质量浓度。另配上述质量浓度血清样品各3份，每份2 mL，在4℃冰箱中放置，分别在2，4，7 d取样，测定丙戊酸镁的质量浓度。结果见表2，表明丙戊酸镁血清样品在室温放置21 h内稳定，在4℃冷冻条件下放置7 d内稳定。

2.5 质控评价

2.5.1 回顾性质控图分析

2016年1月至12月共测定质控样本216份，其中低(11.0 μg ／mL)、中(66.0 μg ／mL)、高(200.0 μg ／mL)质量浓度质控样本各72个。以各质量浓度质控样本质量浓度（均值）为“靶值线”，即；以±2 s为“警告线”；以±3 s为“失控线”。以测定批次为横坐标，以质量浓度为纵坐标，绘制质控图，详见图2。结果低、中、高质量浓度质控数据基本分布在“靶值线”两侧，无数据超出±3 s“失控线”，故所有质控数据均为“在控”。但低质量浓度质控有2次超出±2 s，提示警告2次；中质量浓度质控有4次超出±2 s，提示警告4次；高质量浓度质控有2次超出±2 s，提示警告2次。3种质量浓度的质控样本都出现了连续几点落在“靶值线”下侧，提示可能存在一定程度的系统误差，可能与质控样本的批次配制或新标准曲线的制作有关。

表2 样品稳定性试验结果(n＝3)

图2 2016年质控数据分布图

2.5.2 数据分布

图3 各质量浓度质控数据分布比例图

2.5.3 年度质控结果

将2016年1月至12月质控监测结果进行汇总统计，求得其平均值、标准差、回收率、RSD，详见表3。结果表明，低、中、高3组质量浓度的实测值在标示值的±15%以内，批间 RSD小于15%，符合2015年版《中国药典（四部）》中“9012生物样品定量分析方法验证指导原则”，提示改进的方法测定丙戊酸镁血药浓度的长期稳定性和精密度均良好。

表3 2016年度质控结果

3 讨论

3.1 色谱件选择

本研究中丙戊酸镁标准品血清及质控血清的配制可有效避免溶液保存引起的系统误差，且无需复融质控血清，可简化操作步骤。为除去样品血清中蛋白质等杂质的干扰，要充分加入硫酸溶液，样品血清与硫酸体积比最好为1∶1。参考文献[13]，考察流动相条件时发现流动相为甲醇－水（75∶25）时环己甲酸和丙戊酸镁衍生物保留时间分别为 5.8 min和 9.0 min，耗时较长；选择甲醇－水（81∶19）时保留时间分别为4.1 min和5.4 min，分离度(R)＞ 1.5。提示内标和标准品均与血清中的其他组分色谱峰能很好地分离，检测时间可由原来的10 min缩短至6 min，因而流动相选择甲醇－水(81∶19)将色谱条件改进为后者。衍生化反应在50℃水浴必须保证反应20 min，反应充分完全，否则将影响检测结果。文献[13]中采用内标峰高法进行定量分析，由于峰高法受柱效、峰形、保留时间影响较大，而峰面积法受上述影响不大，因而本研究中采用内标峰面积法进行定量计算。

3.2 质控评价

本研究中所测定丙戊酸镁血药浓度的批内、批间及年度质控样本的精密度和准确度均符合2015年版《中国药典（四部）》“9012生物样品定量分析方法验证指导原则”的规定。年度质控数据基本成正态分布，提示误差来源主要为随机误差。尽管质控图提示可能有一定的系统误差存在，但所有质控数据仍在“在控”范围内，因此本方法通过室内质控保证了血药浓度监测质量。年度质控评价提示可能出现的系统误差将密切关注，采取仪器校正、规范操作、内标对照等措施，及时纠正，以便为临床提供快速、灵敏、准确、可靠的血药浓度监测服务。

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Improvement of HPLC for Determination of Serum Concentration of Magnesium Valproate and Assesssment of Quality Control

Yang Yingda,He Qiuyue,Li Dexiu,Wang Tianqi
(Department of Pharmacy,Hubei Provincial Hospital of Itegrated Chinese＆ Western Medicine,Wuhan,Hubei,China 430000)

Objective To improve the HPLC method for determining the concentration of magnesium valproate in human serum.Methods The serum was precipitated by sulfuric acid(1.0 mol／L),the cyclohexane carboxylic acid was used as an internal standard and 2 －bromo － 4′－ nitroacetophenone was used as derivation agent.The HPLC method was used,the chromatographic column was C18column(200 mm × 4.6 mm,10 μm),the mobile phase was methanol－ water(81:19),the detection wavelength was 265 nm,the flow rate was 1.0 mL ／min,and the column temperature was 25 ℃ .Totally 216 quality control samples of the hospital in 2016 were statistically analyzed.Results The retention time of cyclohexanecarboxylic acid derivate and magnesium valproate derivative were 4.1 min and 5.4 min,respectively,the linearrange was 11.0 － 200.0 μg／mL(r＝ 0.999 3),and the average recovery was98.2% －102.5%,the RSDs of within batch and between batch were less than 2.3%,RSD of stability was less than 3.9%,RSD of quality control data in 2016 were less than 15%,which accorded with the requirement of Chinese Pharmacopoeia(2015 Edition,Volume Ⅳ).The quality controlbasically accorded with the normaldistribution in 2016,and allthe quality controldata were in control.Conclusion The improved method is simple,rapid and accurate,it is suitable for monitoring the concentration of magnesium valproate in serum,and the internal quality control ensures the monitoring quality of serum concentration.

magnesium valproate;HPLC;blood concentration monitoring;assesssment of quality control

R914.1；R971＋.6

A

1006－4931(2017)23－0010－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.003

武汉药学会医院药学研究基金[武药会201502003]。

杨颖达（1981－），女，博士研究生，主管药师，研究方向为临床药学，(电子信箱)502099281＠qq.com。

王天 ，男，大学本科，主管药师，研究方向为临床药学，（电子信箱）jeff200082＠163.com。

2017－07－19)