5-羟色胺在非糜烂性反流病中表达的研究

姜志茹， 赵 雷， 郭 海， 郑爱萍， 李明华

北京大学深圳医院 1.老年科；2.消化科；3.病理科；4.中心实验室，广东 深圳 518036

5-羟色胺在非糜烂性反流病中表达的研究

姜志茹1， 赵 雷1， 郭 海2， 郑爱萍3， 李明华4

北京大学深圳医院 1.老年科；2.消化科；3.病理科；4.中心实验室，广东 深圳 518036

目的研究5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)在质子泵抑制剂(proton pump inhibtor, PPI)疗效差的非糜烂性反流病(non-erosive reflux disease, NERD)患者和PPI有效的NERD患者食管黏膜中的表达。方法北京大学深圳医院门诊60例NERD患者分为两组：PPI疗效差组21例，PPI有效组39例，10名健康志愿者为正常对照组，胃镜下取食管黏膜标本。免疫组化法测定肥大细胞的表达，免疫印迹法测定5-HT4受体、5-羟色胺转运体(serotonin transporter, SERT)的蛋白表达。结果PPI疗效差组与PPI有效组的肥大细胞表达分别为：(17.05±2.13)%、(18.37±3.86)%，两组间差异无统计学意义，均高于正常对照组(3.94±2.13)%(P<0.05)。PPI疗效差组、PPI有效组和正常对照组的5-HT4R蛋白吸光度比值分别为：1.08±0.17、0.96±0.15、1.10±0.18，各组间差异无统计学意义(P>0.05)。SERT蛋白吸光度比值：PPI疗效差组(1.22±0.20)>PPI有效组(0.63±0.14)>正常对照组(0.21±0.09)(P<0.05)。结论SERT的高表达可能参与了PPI疗效差的NERD的发病机制。

5-羟色胺；非糜烂性反流病；质子泵抑制剂

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一种常见的消化道动力障碍性疾病，指胃内容物反流导致不同程度的食管黏膜损伤，可引起反酸、烧心等典型的反流症状。根据内镜和病理,GERD分为非糜烂性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)、反流性食管炎和Barrett’s食管，其中NERD占GERD的65%～70%[1]。质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)是GERD的主要治疗方法，但对于40%～50%的NERD患者往往不能获得满意疗效，相关发病机制目前尚不明确，可能与NERD患者食管的高敏感性和运动异常等因素有关[2]。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是调节胃肠道运动、分泌及感觉功能的重要神经递质，在消化道动力障碍性疾病发病机制中的研究越来越受到重视。但5-HT是否参与了PPI疗效差的NERD患者的发病机制，目前尚无相关研究。本项目拟研究5-HT在PPI疗效差的NERD患者和PPI有效的NERD患者食管黏膜中的表达，探讨5-HT是否参与了PPI疗效差的NERD发病机制，为临床上选择5-HT相关药物治疗PPI疗效差的NERD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年9月至2016年10月北京大学深圳医院门诊的60例NERD患者，男34例，女26例，年龄(50.2±7.5)岁(36～65岁)。纳入标准(依据2013年美国胃肠病学会颁布的《胃食管反流病诊断和治疗指南》[3])：(1)年龄18～80岁；(2)有典型的烧心、反酸、反食、胸痛等反流症状，病程≥3个月，GERD评分≥8分；(3)胃镜检查显示食管黏膜无糜烂、溃疡；(4)无消化道其他器质性疾病及消化系统手术史，无可引起胃食管反流症状的全身系统性疾病；(5)4周内未接受过抑酸、促动力或抗抑郁等特殊治疗。对于NERD患者给予PPI试验性治疗(埃索美拉唑镁肠溶片20 mg 2次/d，治疗2周)，根据PPI治疗前后GERD评分改善程度分为两组：PPI疗效差组(评分改善≤50%)21例，PPI有效组(评分改善>50%)39例。选取10名健康志愿者为正常对照组，无消化道疾病史，胃镜检查正常。所有研究对象于胃镜检查时采集食管黏膜标本，标本分为两部分，一部分置于甲醛固定、石蜡包埋，另一部分置于-80 ℃中冻存备用。

1.2实验方法

1.2.1 免疫组化法测定肥大细胞的表达：石蜡切片常规脱蜡、水化，沸水浴中1 mmol/L EDTA(pH 8.0)修复抗原，封闭内源性过氧化物酶。Envision法进行免疫组化染色，抗肥大细胞类胰蛋白酶抗体(abcam)的工作浓度为1∶100，PBS为阴性对照，滴加二抗后DAB显色，光镜观察。以细胞浆呈棕黄色为肥大细胞表达阳性，高倍视野(400×)下随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。

1.2.2 Western blotting测定5-HT4受体(5-HT4R)、5-羟色胺转运体(serotonin transporter，SERT)的蛋白表达：依据RIPA试剂盒说明书提取冻存组织细胞内总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，以80 μg蛋白上样进行80 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V恒压电泳约25 min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处换120 V恒压电泳约1 h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部。电转法(100 V，1 h)将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上，质量浓度为100 g/L的脱脂奶粉封闭2 h，与5-HT4R抗体(abcam，1∶1 000稀释)、SERT抗体(abcam，1∶5 000稀释)及β-actin抗体(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。ECL法检测蛋白条带，X线曝光，凝胶电泳分析系统对结果进行扫描分析并拍照。结果以与内参β-actin蛋白条带吸光度比值表示。

2 结果

2.1免疫组化法测定肥大细胞的表达PPI疗效差组与PPI有效组的肥大细胞表达分别为：(17.05±2.13)%、(18.37±3.86)%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)，均高于正常对照组(3.94±2.13)%(P<0.05，见图1)。

2.2Westernblotting测定5-HT4R、SERT的表达5-HT4R蛋白表达：PPI疗效差组、PPI有效组和正常对照组的5-HT4R蛋白吸光度比值分别为：1.08±0.17、0.96±0.15、1.10±0.18，各组间差异无统计学意义(P>0.05)。SERT蛋白表达：PPI疗效差组(蛋白吸光度比值1.22±0.20)>PPI有效组(蛋白吸光度比值0.63±0.14)>正常对照组(蛋白吸光度比值0.21±0.09)，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

图2 SERT、5-HT4R的蛋白表达 A：PPI疗效差组；B：PPI有效组；C：正常对照组Fig 2 Expressions of SERT and 5-HT4R A: poor effection of PPI group; B: good effection of PPI group; C: normal control group

3 讨论

NERD是指存在典型胃食管反流的临床症状，但内镜下无食管黏膜损伤的一种疾病。NERD患者易合并精神心理异常和并存功能性胃肠病，PPI治疗缓解率低，NERD中40%～50%患者对PPI治疗无反应[4]。NERD患者对PPI治疗无反应的原因可能与酸抑制不完全、食管对酸的高敏感性、食管壁扩张的高敏感性、十二指肠肠液的反流、食管运动异常、持续的食管收缩和心理因素等方面有关[5]。其中，有关NERD患者食管高敏感性的确切机制尚不明确，目前研究[6]表明，食管黏膜上初级传入神经感受器被化学刺激(如酸刺激)、机械刺激(如高振幅蠕动收缩)、温度刺激(如冷、热流体)和其他内在刺激(如压力、精神心理作用)激活而产生动作电位，动作电位信号再由迷走神经和脊神经通路传至中枢而引起食管高敏感，这一过程由外周机制(食管感觉神经纤维末梢致敏)和中枢机制(脊髓、大脑中枢致敏)介导。

5-HT也称血清素(serotonin)，90%存在于消化道黏膜，8%～10%存在于血小板，1%～2%存在于中枢神经系统，是调节胃肠道运动、分泌及感觉功能的重要神经递质，与内脏高敏感的发生有关[7]。5-HT主要来源于消化道黏膜的肥大细胞、嗜铬细胞、部分胃肠道肌间神经丛神经元及黏膜下神经丛的神经节纤维及细胞，当受到外界刺激时，致敏的肥大细胞、嗜铬细胞脱颗粒向周围组织中释放5-HT，5-HT通过与5-HT受体结合而发挥生理效应，而释放入细胞间隙的5-HT可被5-SERT再摄入细胞内而被代谢[8]。目前已发现7种5-HT受体类型，并可进一步细分为16种亚型，其中，5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4和5-HT7存在于人消化道，尤其以5-HT4R和消化道的功能调节关系密切[9]。5-HT4R激动剂通过兴奋5-HT4R，增加蛋白激酶途径的信号传导，促进降钙素基因相关肽、P物质、乙酰胆碱等的释放，作用于周围神经末梢，从而改变胃肠感觉和动力[10]。

Yang等[11]研究发现反流性食管炎大鼠的5-HT、SERT表达高于NERD组及对照组，5-HT4R的表达低于NERD组及对照组，推测5-HT4R受体介导的信号通路异常导致食管动力障碍，酸停留时间延长，食管黏膜受损。Saegusa等[12]研究发现GERD大鼠食管下括约肌5-HT4R的mRNA表达减少，从而导致食管下括约肌动力异常，应用5-HT4R受体激动剂，可以降低一过性食管下括约肌松弛的频率，缩短酸性物质在食管停留的时间。

5-HT再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)通过抑制5-HT再摄取增加突触间隙中5-HT的含量，是临床上常见的一种抗抑郁药，近年来也用于功能性胃肠病的治疗[13]，其疗效机制目前尚不明确，SSRIs可能是通过中枢作用来调整中枢认知功能，减缓对应激反应性等改善内脏高敏感性，也可能是直接作用于外周胃肠道的神经递质发挥疗效。Viazis等[14]研究发现丙咪嗪可提高正常人食管的痛阈，改善胸痛症状，曲唑酮能降低食管的化学和机械敏感性。Broekaert等[15]研究发现西酞普兰可以降低食管的化学和机械敏感性，对食管的动力无影响。

本研究根据PPI治疗前后GERD评分改善程度将NERD患者分为PPI疗效差组与PPI有效组。通过免疫组化法测定食管黏膜肥大细胞的表达，发现两组肥大细胞的表达比较，差异无统计学意义。通过Western blotting测定5-HT4R、SERT的表达，发现PPI疗效差组的SERT的表达高于PPI有效组，两组5-HT4R的表达比较，差异无统计学意义。推测SERT的高表达可能通过减少突触间隙中5-HT的含量，经由外周机制导致NERD患者食管的高敏感性，参与了PPI疗效差的NERD的发病机制，进而推测SSRIs可能通过外周机制改变5-HT的含量，发挥其对PPI疗效差的NERD的治疗作用。

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(责任编辑：陈香宇)

Expressionof5-hydroxytryptamineinnon-erosiverefluxdisease

JIANG Zhiru1, ZHAO Lei1, GUO Hai2, ZHENG Aiping3, LI Minghua4

1.Department of Gerontology; 2.Department of Gastroenterology; 3.Department of Pathology; 4.Central Laboratory, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

ObjectiveTo investigate the expression of 5-hydroxytryptamine (5-HT) in non-erosive reflux disease (NERD) with poor effection and good effection of proton pump inhibitor (PPI).MethodsSixty patients of NERD were divided into poor effection of PPI group (21 patients), good effection of PPI group (39 patients) and 10 volunteers as the normal control group, esophageal mucous membrane biopsy were obtained by gastroscopy. The expression of mast cells was determined by immunohistochemistry technique, the expressions of 5-HT4 receptor and serotonin transporter (SERT) were determined by Western blotting.ResultsThe mast cell expression rate was (17.05±2.13)% in poor effection of PPI group and (18.37±3.86)% in good effection of PPI group (with no statistical difference), higher than that in the normal control group (3.94±2.13)% (P<0.05). The 5-HT4 receptor (5-HT4R) protein absorbance ratio by Western blotting were 1.08±0.17, 0.96±0.15 and 1.10±0.18 in poor effection of PPI group, good effection of PPI group and normal control group, respectively, with no statistical difference (P>0.05). The SERT protein absorbance ratio: poor effection of PPI group (1.22±0.20)> good effection of PPI group (0.63±0.14)>normal control group (0.21±0.09) (P<0.05).ConclusionThe up-regulation of SERT protein expression might be involved in the pathogenesis of NERD with poor effection of PPI.

5-hydroxytryptamine; Non-erosive reflux disease; Proton pump inhibitor

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.021

深圳市科技计划项目(JCYJ20150403091443306)

姜志茹，博士，副主任医师,研究方向：胃食管反流病。E-mail：japonica@sina.com

R57

A

1006-5709(2017)11-1282-03

2016-12-30