植入前遗传学筛查中卵裂期与囊胚期胚胎染色体异常的比较

施文浩，张四林，王永博，师娟子

(西北妇女儿童医院生殖中心，陕西 西安 710003)

植入前遗传学筛查中卵裂期与囊胚期胚胎染色体异常的比较

施文浩，张四林，王永博，师娟子

(西北妇女儿童医院生殖中心，陕西 西安 710003)

目的通过种植前遗传学筛查患者的胚胎和染色体结果分析，比较卵裂期与囊胚期胚胎染色体数目异常。方法收集2015年1月1日至2017年4月30日西北妇女儿童医院生殖中心行种植前遗传学筛查(PGS)患者，胚胎培养至卵裂期和囊胚期活检，PGS检测采用array-CGH (BlueGnome 24SureV3)，比较卵裂期与囊胚期胚胎染色体的结果。结果PGS共活检348枚胚胎，其中卵裂期67例，囊胚期281例，囊胚期胚胎的整倍体率高于卵裂期胚胎(43.68% vs 14.75%，Plt;0.01)，卵裂期胚胎中异常染色体的数目≥5条最为常见(42.31%)，而囊胚中异常染色体数目为1条最为常见(53.79%)。卵裂期胚胎中20,21,16,14号染色体发生率较高(gt;5.00%);8,4,12号染色体发生率较低(lt;3.00%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色体，21,15号染色体发生率较高(gt;5.00%)；10,17,12,3号染色体发生率较低(lt;3.00%)。在染色体缺失异常中，20，16，22，1，21号染色体发生率较高(8.14%，6.98%，6.98%，6.59%，5.81%,均gt;5.50%)；3号染色体缺失发生率低(0.78%)。染色体重复异常中19,16,22,21，性染色体，7,15,13号染色体发生率较高(gt;5.50%)；12号染色体缺失发生率最低(1.46%)。结论囊胚期胚胎的整倍体率高于卵裂期胚胎，卵裂期胚胎中异常染色体的数目≥5条最为常见，囊胚中异常染色体数目为1条最为常见。卵裂期胚胎中20,21,16,14号染色体发生率较高，而囊胚22,16,19,7,1,性染色体，21,15号染色体发生率较高。

植入前遗传学筛查；卵裂期胚胎；囊胚；染色体异常；非整倍体

在自然生殖发育过程中，细胞分裂时期染色体不分离、减数分裂时期染色单体提早分离和染色体丢失引起染色体异常包括数量和结构异常，数量异常更为常见[1]。目前在胚胎种植前筛查的主要技术手段就是胚胎植入前遗传学筛查或诊断(preimplantationgeneticscreening，PGS)，在胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，分析胚胎非整倍体风险的一种早期产前筛查方法，从而挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低流产率预防出生缺陷。PGS检测可在卵裂期和囊胚期，已有较多文献报道囊胚期比卵裂期显出更多的优势，如高整倍体率及低损伤低嵌合率等[2]，但是关于卵裂期和囊胚期胚胎各染色体异常的发生频率及差异尚未充分的报道。胚胎发育过程不同阶段染色体异常发生率对研究胚胎染色体与发育的关系非常重要，因此本文拟从PGS病例中研究卵裂期与囊胚期的检测结果差异，分析卵裂期与囊胚期胚胎染色体数目异常的频率和特点。

1资料与方法

1.1研究对象与分组

收集2015年1月1日至2017年4月30日在西北妇女儿童医院生殖中心行PGS的常规体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)患者，以其所检测胚胎为研究对象。PGS检测在西北妇女儿童医院医学遗传中心完成，采用微阵列比较基因组杂交(array-comparative genomic hybridization,array-hGH)检测。所有进入临床PGS周期的患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 IVF及胚胎活检

采用常规的促排卵方案，当优势卵泡中有1个直径达到18mm(或者1/3个卵泡达18mm)注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)10 000IU，36～38h后经阴道超声下取卵。取卵后4～6h常规卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序贯培养(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天[3]，活检时间为受精后第3～6天，卵裂期胚胎在第3天进行卵裂球活检，活检1枚卵裂球送检；囊胚在受精后第5天或第6天活检，活检部分外胚层细胞(10个左右)送检。活检后卵裂期胚胎或囊胚冷冻保存。

1.2.2 PGS检测

活检细胞采用单细胞基因组扩增，采用SurePlex DNA Amplification System 试剂盒进行全基因组扩增，然后通过array-CGH方法(BlueGnome 24SureV3 package kit)对扩增后的产物进行检测，BlueFuse Multi软件分析并出具报告。

1.3统计学分析

全部数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，率的统计学检验采用χ2检验，等级资料率的检验采用秩和检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1基本数据

PGS共活检348枚胚胎，其中整倍体胚胎数目为123(38.20%)，非整倍体胚胎数目为199(61.80%)，不同活检时期(受精后第3～6天)活检的PGS基本数据详见表1。其中卵裂期与囊胚期的整倍体与非整倍体率比较差异有统计学意义(χ2=17.52,Plt;0.01)，见表1。

2.2异常染色体数目的发生频率

卵裂期与囊胚期中单个胚胎异常染色体数目的发生率详见表2，单个卵裂期胚胎中异常染色体的数目≥5条发生率最高(42.31%)，2条和3条染色体发生率低(3.85%，5.77%)；单个囊胚中异常染色体数目为1条的发生率最高(53.79%)，3条和4条染色体发生率低(10.34%，4.14%)。比较卵裂期与囊胚期的不同异常染色体数目发生率有显著统计学差异(Z=-4.61，Plt;0.01)，见表2。

表1 不同活检时期PGS基本数据(n)

注：D3～D6表示活检时间为受精后第3～6天；嵌合体按非整倍体计算；*Plt;0.01(χ2=17.52)。

表2 不同活检时期的单个胚胎异常染色体数目的发生频率(n)

注：D3～D6表示活检时间为受精后第3～6天；*Plt;0.01(Mann-WhitneyZ=-4.61)。

2.3卵裂期与囊胚期各染色体缺失/重复的发生频率

2.3.1缺失/重复的发生率

卵裂期与囊胚期PGS中各染色体缺失/重复的发生频率(见表3、图1、图2)。胚胎染色体缺失中20，16，22，1，21号染色体发生率较高(8.14%，6.98%，6.98%，6.59%，5.81%,均gt;5.50%)；3号染色体缺失发生率最低(0.78%)。胚胎染色体重复中19,16,22,21，性染色体，7,15,13号染色体发生率较高(gt;5.50%)；12号染色体缺失发生率最低(1.46%)，见表3。

表3 卵裂期与囊胚期PGS中各染色体缺失和(或)重复的发生频率

图1 PGS结果中各染色体缺失与重复的发生频率

Fig. 1 Frequency of deletion and duplication of chromosomes in PGS results

2.3.2卵裂期与囊胚期不同染色体异常的发生频率

卵裂期胚胎中20,21,16,14号染色体发生率较高(gt;5.00%)；8,4,12号染色体发生率较低(lt;3.00%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色体，21,15号染色体发生率较高(gt;5.00%)；10,17,12,3号染色体发生率较低(lt;3.00%)。

图2 卵裂期与囊胚期PGS结果中的各染色体的异常频率

3讨论

3.1胚胎的非整倍体

非整倍体是最常见的染色体数目异常,发生于卵母细胞或胚胎可导致胚胎种植失败、自发性流产和新生儿出生缺陷。据欧洲人类生殖与胚胎学会的10年PGS数据统计，共活检89 373枚胚胎，仅有33%的胚胎染色体正常适合移植[4]，研究发现卵裂期胚胎染色体异常率为43.20%～70%[5-6]，囊胚期胚胎染色体异常率为39.10%[7]。文献报道早期流产组织的异常率为54.7%～70.9%，以染色体数目异常最为常见，三体居多，如16-三体、15-三体、21-三体等[8-9]。然而关于卵裂期胚胎及囊胚的染色体异常特点却鲜有报道。胚胎发育不同时期染色体异常的特点可能参与胚胎发育等生物学过程，因此，有必要对早期胚胎不同发育阶段各染色体异常频率进行研究。

3.2卵裂期与囊胚期染色体数目异常比较

本研究结果提示囊胚期胚胎的整倍体率高于卵裂期胚胎(Plt;0.001)，卵裂期胚胎中异常染色体的数目≥5条最为常见(42.31%),而囊胚中异常染色体数目为1条最为常见(53.79%)。卵裂期胚胎中20,21,16,14号染色体发生率较高(gt;5%)；8,4,12号染色体发生率较低(lt;3%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色体，21,15号染色体发生率较高(gt;5%)；10,17,12,3号染色体发生率较低(lt;3%)。在染色体缺失异常中，20，16，22，1，21号染色体发生率较高(均gt;5.50%)；3号染色体缺失发生率低(0.78%)。染色体重复异常中19,16,22,21，性染色体，7,15,13号染色体发生率较高(gt;5.50%)；12号染色体缺失发生率最低(1.46%)。由此可见，胚胎发育过程中，卵裂期与囊胚期胚胎染色体异常的频率及种类存在差异。

胚胎染色体异常与胚胎发育关系密切[10]，有研究指出染色体异常可导致不同阶段胚胎发育停滞，延长培养时间相对可获得较高比例的正常胚胎[11]。染色体异常的胚胎可能在胚胎的某些特定阶段发生发育阻滞，由此推测不同阶段胚胎的染色体异常发生率可能存在差异。因此通过对不同发育阶段的染色体异常发生率比较，可为胚胎染色体异常与胚胎发育的关系提供相关证据。

通过本研究PGS患者的染色体结果分析得出，囊胚期胚胎的整倍体率高于卵裂期胚胎，卵裂期胚胎中异常染色体的数目≥5条最为常见，囊胚中异常染色体数目为1条最为常见。卵裂期胚胎中20,21,16,14号染色体发生率较高，而囊胚22,16,19,7,1,性染色体，21,15号染色体发生率较高。卵裂期与囊胚期不同染色体发生的频率和特点有差异。

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[专业责任编辑：童国庆]

Comparisonofchromosomalabnormalitiesincleavagestageandblastocyststageinpreimplantationgeneticscreening

SHI Wen-hao, ZHANG Si-lin, WANG Yong-bo, SHI Juan-zi

(ArtificialReproductiveCenter,NorthwestWomenandChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

ObjectiveTo compare the chromosomal abnormalities in cleavage and blastocyst stages by analyzing the chromosome results of patients undergoing preimplantation genetic screening.MethodsPatients undergoing preimplantation genetic screening (PGS) in reproductive center of Northwest Women and Children’s Hospital from January 1, 2015 to April 30, 2017 were collected, and embryo biopsy was carried out when embryo was cultured to cleavage and blastocyst stage. Array-comparative genomic hybridization (array-CGH) (Blue Gnome 24SureV3) was adopted for PGS. Embryo chromosome analyzing results in blastocyst and cleavage stages were compared.ResultsA total of 348 embryos were examined in PGS, including 67 embryos in cleavage stage and 281 in blastocyst stage. Aneuploidy rate of embryo in blastocyst stage was higher than that in cleavage stage (43.68% vs 14.75%,Plt;0.01). It was most common in embyos in cleavage stage that more than 5 chromosomes were abnormal (42.31%) while one abnormal chromosome in blastocysts was most common (53.79%). In embryos in cleavage stage, incidence of abnormality in chromosome 20, 21, 16 and 14 was high (gt;5.00%), while that in chromosome 8, 4 and 12 was low (lt;3.00%). Abnormal rate of sex chromosome 22, 16, 19, 7 and 1 and chromosome 21 and 15 was high in blastocysts (gt;5.00%), but abnormal rate of chromosome 10, 17, 12 and 3 was low (lt;3.00%). For chromosome deletion abnormalities, incidence of chromosome deletion in chromosome 20, 16, 22, 1 and 21 was high (8.14%, 6.98%, 6.98%, 6.59% and 5.81%, respectively, all above 5.50%), and incidence of chromosome deletion was low in chromosome 3 (0.78%). Incidence of chromosome duplication abnormality in sex chromosome 19, 16, 22 and 21 and chromosome 7, 15, 13 was high (gt;5.50%), and that in chromosome 12 was the lowest (1.46%).ConclusionAneuploidy rate of embryo in blastocyst stage is higher than that in cleavage stage. It is most common in embryos in cleavage stage that more than 5 chromosomes are abnormal, and one abnormal chromosome in blastocyst is most common. Incidence of abnormality in chromosome 20, 21, 16 and 14 is high in embryos in cleavage stage, while abnormality in sex chromosome 22, 16, 19, 7 and 1 and chromosome 21 and 15 is high in blastocyst.

preimplantation genetic screening (PGS); embryos in cleavage stage; blastocyst; chromosomal abnormalities; aneuploidy

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.017

R71

A

1673-5293(2017)11-1367-04

2017-07-11

施文浩(1985—)，男，主治医师，硕士，主要从事生殖医学的研究。

师娟子，主任医师。