Ru/Al2O3催化植物油异构化制备共轭亚油酸的研究

刘书来 张 生 王 勇 徐学兵 丁玉庭

(浙江工业大学海洋学院1，杭州 310014) (浙江工业大学海洋研究院2，杭州 310032) (丰益(上海)生物技术研发中心有限公司3， 上海 200137)

Ru/Al2O3催化植物油异构化制备共轭亚油酸的研究

刘书来1,2张 生1王 勇3徐学兵3丁玉庭1,2

(浙江工业大学海洋学院1，杭州 310014) (浙江工业大学海洋研究院2，杭州 310032) (丰益(上海)生物技术研发中心有限公司3， 上海 200137)

以棉籽油为原料，氧化铝载钌(Ru/AlO3)为催化剂，对亚油酸异构化制备共轭亚油酸进行了研究。采用GC-MS分析不同温度、搅拌速率、催化剂添加量条件下产物中主要成分含量。通过判断反应前后棉籽油甘三酯Sn-1,2,3位脂肪酸组成的变化，评价金属钌催化剂的选择异构化催化特性。试验表明，165 ℃下Ru/Al2O3用量为棉籽油质量的2.5%，搅拌速率800 r/min, N2环境，反应36 h条件下，亚油酸转化率可达87.78 %，共轭亚油酸的选择性为57.17%，得到产物中共轭亚油酸含量为289.3 mg/g棉籽油。随反应时间延长，顺、反共轭亚油酸会向双反式共轭亚油酸转化，产物中的反式油酸含量有所增加，并且，Sn-1,3位的共轭亚油酸选择性异构化率高于Sn-2位。

棉籽油 共轭亚油酸 异构化 Ru/Al2O3

CLA是亚油酸(LA)衍生的共轭双烯的一系列位置和几何异构体的总称[1]。亚油酸(C18∶2)在碳链9位和12位分别具有2个顺式构型双键，而共轭亚油酸包括碳7,9-、8,10-、 9,11-10,12-和11,13-位上的顺，顺(c,c)；反，反(t,t)；顺，反(c,t)；反，顺(t,c)4种不同构象的所有同分异构体。应用碳13核磁共振波谱法已发现20种CLA同分异构体。天然共轭亚油酸一般存在于肉及乳制品中，主要以9c,11t-CLA为主，占75%～90%[2]。

已有大量文献报道共轭亚油酸具有影响胰岛素敏感度，免疫调节，并且可以预防和治疗动脉粥样硬化，乳腺癌，胃癌，皮肤癌，结肠癌，前列腺癌等疾病，9c，11t-CLA主要起到抗癌功效，10t，12c-CLA在改变机体组成(增加肌肉/脂肪比例)方面发挥作用[3-7]，同时CLA在动物生产方面的优越性能：减少体脂沉积、促生长、提高饲料转化率等方面逐渐被发现[8]。

生产CLA的原料须是富含亚油酸的油脂，形式可以是甘三酯、脂肪酸或者脂肪酸酯。但是产物中CLA浓度直接取决于原料中亚油酸含量。通过综合比较，棉籽油作为一种亚油酸含量高(57.6%)，价格便宜的植物油脂，是目前比较理想的原料,并可作为饲料用油。

当前，工业生产CLA依然以碱异构化法为主，这种方法存在着产物中游离脂肪酸难分离，用碱量和有机溶剂量较大，环保污染严重等缺陷。近年来，致力于非均相催化剂的使用的相关研究越来越多，例如使用非均相催化剂将亚油酸异构化为共轭亚油酸(conjugated linoleic acids, CLA)[9]。非均相催化剂催化底物异构化，可直接实现由甘三酯(TG)至富含共轭亚油酸的甘三酯(CLAG)的转化，在催化产物与催化剂易过滤分离且易回收等方面优势明显。钌作为一种过渡金属，存在空的d轨道，可与脂肪酸链π键相互作用，从而激活相邻C-H键，发生异构化反应。载钌催化剂催化亚油酸氢化/异构化反应流程如图1所示。本研究选择氧化铝载钌(5% Ru/Al2O3)作为催化剂，棉籽油为原料油，研究其异构化过程中反应条件：温度、转速、催化剂添加量、反应时间对催化效率的影响，并考察催化剂是否具有选择催化特性。以期为CLA的生产提供技术支持，开阔CLA的应用领域至饲料行业，这对于畜产品生产中避免使用瘦肉精和抗生素有重要意义。

图1 亚油酸氢化/异构化反应流程图

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

精炼棉籽油：嘉里粮油工业有限公司；氧化铝载钌(Ru/Al2O3)：阿法埃莎(中国)化学有限公司；亚油酸甲酯(≥97%，基于GC分析)：上海源叶生物科技有限公司；正己烷(分析纯)：上海化学试剂公司；共轭亚油酸甲酯(9c,11t-CLA、10t,12c-CLA、9t,11t-CLA混合样,≥99%)(色谱纯)、猪胰脂肪酶、2’,7’-二氯荧光素：Sigma公司；HSGF 254 20×20 cm 1.0 mm薄层层析硅胶板：烟台江友硅胶开发有限公司。

1.2 仪器和设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南予华仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；Thermo Fisher ISQ GC/MS气质联用色谱仪：赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

1.3 试验方法

1.3.1 异构化反应

1 g棉籽油加至耐压管式反应器，冲入N2，搅拌速率1 000 r/min; Ru/Al2O3用量分别为0.05 g； 0.025 g或0.01g Ru/Al2O3；油浴加热至不同温度(125、145、165、185 ℃)伴随磁力搅拌开始反应，经不同时间，过滤分离得到含共轭亚油酸棉籽油产物。本研究异构化反应均为间歇反应。

1.3.2 脂肪酸甲酯制备方法[10]

取100 μL棉籽油放入10 mL具塞试管，并加入1 mL氢氧化钠甲醇溶液，摇匀后置于80 ℃水浴中振荡约5 min后至油滴消失，冷却至室温，加入1 mL 15%三氟化硼甲醇溶液和0.3 mL对苯二酚甲醇溶液，再次放置于80 ℃水浴中振荡约2 min后，冷却至室温，立即加入0.2 mL盐溶液(370 mg/mL NaCl+1.5 mg/mL K2CO3水溶液)，振荡10 s，再加入1 mL正庚烷，振荡10 s使之分层，小心吸取上清液直接用于气质联用色谱测定。

1.3.3 共轭亚油酸组分及含量分析

采用气相色谱质谱联仪分析，分析条件为：色谱柱：Supelco-2560 ( 120 m×0.25 mm，0.25 μm )；升温程序：170 ℃保持1 min，以0.8 ℃/min升至195 ℃，保持12 min，再以0.8 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；最后以5 ℃/min升至220 ℃，保持1 min。载气(N2)流速1.0 mL/min,进样量：5 μL；分流比：1∶100。

1.3.4 共轭化产物区域选择性分析[11]

取50 mg棉籽油置于20 mL试管中，依次加入30 mg猪胰脂肪酶，3 mL1.0 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)，0.25 mL 2.2%m/VCaCl2溶液，0.625 mL 0.1%m/V胆酸钠，40 ℃水浴中反应10 min后，加入5 mL无水乙醇和5 mL 6.0 mol/L HCl终止反应。试管中液体全部转移至50 mL离心管，加入乙醚10 mL，振荡后在3 000 r/min，10 ℃下离心10 min。取乙醚层，加入适量无水Na2SO4干燥后通N2浓缩。浓缩物和标准品(三油酸甘油酯，2-单油酰甘油酯，亚油酸)同时在硅胶薄层色谱板上点样，展开溶剂∶正己烷∶乙醚∶乙酸(60∶40∶1),室温下展开45～50 min。喷淋2’7’-二氯荧光素显影，将Sn-2单甘酯和游离脂肪酸谱带分别刮下，萃取剂为：氯仿：甲醇(60∶40体积比)，萃取后分别在45 ℃减压旋蒸，最后采用1.3.2方法甲酯化，进行气质联用色谱测定。

1.3.5 Ru/AL2O3形貌电镜表征

氧化铝载钌催化剂的形貌特征通过Tecnai G2 F30 S-Twin型透射电子显微镜观察。

1.4 数据处理

共轭亚油酸各异构体对应的峰，以共轭亚油酸甲酯标准品进行定性和定量分析，峰面积比转化为摩尔分数及CLA质量含量采用的方法来自AOCS Ce 1f-96[10]。摩尔分数指特定的脂肪酸化合物相对于脂肪酸总量百分比。亚油酸的转化率(XLA)用来表示催化剂催化活性，催化剂的特异选择性用以下指标表示：总CLA的选择性转化率(SCLA)，9c,11t-CLA+10t,12c-CLA 的选择性转化率(Sct)，9t,11t-CLA+10t,12t-CLA的选择性转化率(Stt)，产物棉籽油相较于原料棉籽油中亚油酸和硬脂酸的增加量的氢化选择性转化率(SHP)。YCLA，Yct，Ytt，YHP，Yt-Ol分别表示产物棉籽油中总CLA摩尔分数，9c,11t-CLA+10t,12c-CLA的摩尔分数，9t,11t-CLA+10t,12t-CLA的摩尔分数，相较于原料棉籽油中亚油酸和硬脂酸增加的摩尔分数，反式油酸(t-Ol)的摩尔分数。各计算式为：

(1)

YCLA=CLA1-CLA0

(2)

(3)

Yct=(c,t-CLA)1-(c,t-CLA)0

(4)

(5)

Ytt=(t,t-CLA)1-(t,t-CLA)0

(6)

(7)

YHP=Ol1-Ol0+St1-St0

(8)

(9)

式中：LA0、CLA0、(c,t-CLA)0、(t,t-CLA)0、Ol0、St0分别表示原料棉籽油中LA、总 CLA、9c, 11t-CLA+10t,12c-CLA、9t,11t-CLA+10t,12t-CLA、油酸、硬脂酸的摩尔分数。LA1、CLA1、 (c,t-CLA)1、(t,t-LA)1、Ol1、St1、t-Ol分别表示反应后棉籽油中LA、总CLA、9c, 11t-CLA+10t, 12c-CLA、9t,11t-CLA+10t,12t-CLA、油酸、硬脂酸、反式油酸的摩尔分数。

2 结果与分析

2.1 催化机理

通过TEM分析，催化剂上负载钌晶体粒径主体分布于1 nm至3 nm之间。Ru/Al2O3催化亚油酸双键异构化为共轭亚油酸，催化机理可通过Horiuti-Polanyi 理论解释[12],亚油酸被钌化学性吸附至表面，钌原子表面吸附的氢原子解吸给亚油酸形成半氢化中间产物，若钌表面吸附氢的含量较低，半氢化中间产物中结合氢的碳原子相邻碳上会解析出一个氢原子给金属钌催化剂，从而形成异构化反应；对应的，如果金属钌表面吸附氢的含量较高，第二个氢原子会被给予半氢化中间产物从而形成双键氢化反应。半氢化中间体的空间自由旋转，氢的夺取与解析从而导致各种顺反CLA异构体的产生，整个过程如图3所示。关于Horiuti-Polanyi 机理，Touroude等[13]做了丁烯异构化反应，通过研究氘在产物顺式丁烯和反式丁烯上的分布做出了验证。

图2 Ru/Al2O3TEM电镜图

图3 Horiuti-Polanyi理论解释亚油酸异构化图示

2.2 反应温度对Ru/Al2O3催化效果的影响

控制反应条件：棉籽油1 g, Ru/Al2O3添加量25×10-3g,搅拌速率800 r/min,比较不同温度对棉籽油中亚油酸非共轭双键转化为共轭双键的影响，结果如图4。

表1 不同反应温度、搅拌速率、催化剂添加量时，Ru/Al2O3异构化活性数据

注：反应条件为棉籽油1 g,反应时间12 h,充N2保护。

图4 反应温度对共轭异构化反应的影响

图4表明，在相同反应条件下，温度对CLA的生产起到直接的推动作用，温度越高CLA生产速率越快。反应24 h后产物中CLA摩尔分数185 ℃条件下达到27.07%，而对于145 ℃条件下，CLA只有18.28%。由表1中序列1～4，随着温度的升高，LA的转化率仅仅从48.7%增加到52.06%，然而总CLA的选择性转化率从34.77%升至63.75%，氢化选择性转化率从25.38%降低到15.78%,同时Sct/Stt从5.24减少到1.92。温度对共轭化的影响，主要是由于较高温度下催化剂表面化学性吸附氢的量减少[9]，从而使得氢化选择性的减少和异构化选择性的增加，并且从化学键能的角度，高温使得c,t-CLA更趋向于能量更低、更稳定的t,t-CLA发生转化[14]。综合考虑产物中CLA、Sct/Stt及反式油酸含量，选择165℃为较佳反应温度。

2.3 Ru/Al2O3添加量及搅拌速率对催化效果的影响

表1中序列2、5、6表明，当Ru/Al2O3添加量由10×10-3g增加到50×10-3g，LA转化率从20.77%上升至67.76%，总CLA的选择性转化率从48.28%略微增至53.45%。表1中序列2、7、8、9表明，搅拌速率为400 r/min时，LA转化率仅为23.26%，搅拌速率为600、800、1 000 r/min，LA转化率均相对较高。说明只有低搅拌速率(<600 r/min)，才会对异构化过程产生影响。综上可知，Ru/Al2O3添加量和搅拌速率影响LA转化率，对于总CLA的选择性转化并未产生影响。主要原因是搅拌速率过低以及催化剂含量少均会减弱反应中外扩散过程[15]，使得反应底物棉籽油与催化剂接触减少，从而降低了反应速率。

2.4产物中各主要成分选择性随LA转化率变化趋势

控制反应温度165 ℃，棉籽油1 g,催化剂Ru/Al2O3添加25×10-3g，搅拌速率800 r/min，冲N2保护条件不变。反应过程中部分主要产物选择性随LA转化率变化趋势如图5。

图5 Ru/Al2O3催化异构化反应选择性随LA转化率变化图示

图5表明，随着反应进行，LA转化率不断提高，氢化选择性从初始34.83%降至12.72%，与此同时，c,t-CLA和t,t-CLA的选择性转化率分别从26.34%，9.42%上升至39.19%，11.66%。在LA由37.89%至87.78%被转化过程中，c,t-CLA的选择性转化率缓慢从39.19%降至35.14%，而t,t-CLA的选择性转化率由11.66%不断上升至22.03%，氢化选择性维持在10%左右。这主要是由于，反应过程中催化剂表面附着的氢逐渐被消耗，从而导致氢

表2 棉籽油立体选择性分析

化率在反映刚开始大幅下降，反应的不断进行，一方面共轭双键的空间异构化产生部分t,t-CLA，另一方面产物中原有c,t-CLA会逐渐向能量更低更趋稳定的t,t-CLA发生转化[16]。反应36 h后，反应产物中反式油酸含量已上升至3.01%，超过相应国家标准中反式酸含量需低于总脂肪酸含量的3%规定，因此此时终止反应。所以该催化过程并不适合长时间反应，若实际应用，应该综合考虑转化率和选择性等指标。另有研究发现，非均相催化大豆油，富含CLA的大豆油氧化稳定性略有降低[17]。

2.5 棉籽油共轭化产物区域选择性分析

在较佳反应条件：165 ℃，800 r/min, 棉籽油1 g,催化剂Ru/Al2O3添加25×10-3g，充N2保护，24 h后，取反应后棉籽油与原料棉籽油作脂肪酸立体选择性分析，测得反应结果如表2。

表2表明，原料棉籽油中Sn-2位和Sn-1,3位上LA摩尔分数分别为67.83%和49.98%，与文献报道基本一致[18]。催化反应后，Sn-2位LA转化率为21.67%略高于Sn-1,3上LA转化率，但是差异并不显著(P<0.05)[19]。另外发现CLA的选择性转化率，Sn-1,3位上为82.14%明显高于Sn-2位上68.88%，原因可能是由于异构化过程中Sn-2位上的立体空间位阻大于Sn-1,3位。此方面的研究还需进一步深化。

3 结论

研究不同温度，搅拌速率，催化剂添加量，反应时间等条件下的催化效果，得出的较优反应条件为165 ℃，m(棉籽油)∶m( Ru/Al2O3)=40，反应时间36 h，N2条件下，LA转化率为87.78 %，产物中CLA含量可达289.3 mg/g棉籽油，具备工业生产标准。

对富含CLA的产物棉籽油进行分析，发现温度升高及反应时间延长会促使反式油酸的生成和c,t-CLA向t,t-CLA的转变，同时温度升高可降低氢化选择性和提升CLA选择性转化率。另外，搅拌速率过低及催化剂添加量较少会显著降低LA转化率，但是对异构化选择性影响较小。值得注意的是，共轭产物的区域选择性分析，Sn-2位在选择性异构化时会产生明显的空间阻碍，导致此位点上CLA的选择性明显低于Sn-1,3位，其他条件下是否依然存在此现象需要进一步研究。

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Conjugated Linoleic Acid Formation by Isomerization of Cottonseed Oil over Ru/Al2O3Catalyst

Liu Shulai1,2Zhang Sheng1Wang Yong3Xue Xuebing3Ding Yuting1,2

(Ocean College, Zhejiang University of Technology1, Hangzhou 310014) (Institue of Ocean Research, Zhejiang University of Technology2, Hangzhou 310032) (Wilmar (Shanghai) Biotechnology Research & Development Center Co. Ltd3,Shanghai 200137)

Taking the cottonseed oil as raw material and the alumina supported ruthenium (Ru/Al2O3) as catalyst, the isomerization of linoleic acid into conjugated linoleic acid was studied. The contents of main components in the products were analyzed by GC-MS under different temperature, stirring rate and catalyst adding amount. In particular, whether the ruthenium catalyst had selective isomerization properties by determining the fatty acid composition of the Sn-1,2,3 position of the triglyceride of cottonseed oil before and after the reaction. Results showed that the conversion of linoleic acid was 87.78%; the selectivity of conjugated linoleic acid was 57.17% at the condition of N2, 165 ℃, 36 h,800 r/min; and the mass ratio of catalyst to cottonseed oil was 2.5%. The content of conjugated linoleic acid was 289.3 mg/g cottonseed oil in the end product. As the reaction was progressing, the product of c,t-conjugated linoleic acid will be transformed to double trans conjugated linoleic acid. Meanwhile , the product of trans oleic acid content increased, and the selective isomerization rate of Sn-2 was higher than that of Sn-1,3.

cottonseed oil, conjugated linoleic acid , isomerization, Ru/Al2O3

TS222+.1

A

1003-0174(2017)11-0070-06

金龙鱼营养与安全研究基金(201608)

2016-11-03

刘书来，男，1977年出生，副教授，食品生物技术、水产品加工

丁玉庭，男，1963年出生，教授，水产品贮藏与加工