离子色谱法快速测定白酒中多种有机酸和阴离子

宋卫得,李兆杰,杨立明,王 凯,高尧华,李林杰,姜维珍

(1.日照出入境检验检疫局,山东 日照 276826;2.威海出入境检验检疫局,山东 威海 264200)

离子色谱法快速测定白酒中多种有机酸和阴离子

宋卫得1,李兆杰2,杨立明1,王 凯1,高尧华1,李林杰1,姜维珍1

(1.日照出入境检验检疫局,山东 日照 276826;2.威海出入境检验检疫局,山东 威海 264200)

建立了梯度淋洗离子色谱法测定白酒中26种有机酸和阴离子的方法,研究了色谱柱、流速、pH值、淋洗液浓度等实验影响因素,确定了适于26种组分测定的多级梯度淋洗条件。结果表明,当流速为1.00 mL/min,pH值为5.2～6.5时,26种组分在0.02～2.00 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系(R值均＞0.99)。除了苯甲酸外,25种组分检出限(S/N=3)在0.000 11～0.072 80 mg/L;在0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L三个添加浓度水平下,回收率为73.50%～115.13%,精密度实验结果相对标准偏差(RSD)为3.38%～4.97%。

白酒;离子色谱;测定;有机酸;阴离子

白酒是承载着悠久的历史和文化的重要饮品。近年来,随着‘酒精勾兑”、“塑化剂”、“添加剂”等质量安全事件的出现,我国白酒酿造质量引起了社会的高度关注[1]。有机酸和无机阴离子是关乎白酒质量的重要组分,主要引入途径有原料选用、酿造发酵、人为添加等。白酒中有机酸主要有乳酸、乙酸、戊酸、丁酸、甲酸、丙酸、己酸等[2-3],有机酸的种类和含量影响着白酒的品质、口感、稳定性;酒中有毒有害阴离子超标时,亦会危害人体健康。因此,建立白酒中多种有机酸和阴离子同时检测的方法,具有重要的现实意义和应用价值。

目前,有机酸的检测方法有分光光度法[4]、毛细管电泳法[5]、气相色谱法[6]、高效液相色谱法[7-8]、离子色谱法[9-10]等。其中离子色谱法具有简便、快速、灵敏、准确等优点[11-14],在有机酸和阴离子同时测定方面具有明显的技术优势。成霈等[15]建立了酒中5种常见有机酸的离子色谱检测方法,方法快捷灵敏,但测定组分较少且需要42 min方可全部出峰;吴飞燕等[16]建立了电导抑制离子色谱法测定酒中16种有机酸和阴离子的方法,该方法灵敏度高,但测定组分较少、检测时长需要52 min。当前,离子色谱法测定酒中多种有机酸和阴离子的方法研究较少,且存在组分数量分析少、影响因素考察不全、检测时间较长等不足。本研究通过优化色谱条件和分析多种影响因素,建立了白酒中18种有机酸和8种阴离子同时测定的方法,实现了在32 min内快速测定26种组分的目标,从而为我国白酒酿造业提供一种快捷、灵敏、准确的检测技术,切实降低白酒多组分联合检测成本,促进白酒酿造质量控制和产品检测技术的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒:市售;8种阴离子(F-、Cl-、NO3-、NO2-、ClO2-、BrO3-、PO43-、CrO42-)标准溶液(质量浓度为1 000 mg/L):国家有色金属分析测试中心;18种有机酸(D-奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、戊二酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、草酸、顺乌头酸、反乌头酸):德国默克公司;超纯水(电阻率18.2MΩ·cm):实验室自制。

1.2 仪器与设备

ICS2100离子色谱仪(配备电导检测器和自动再生抑制器):美国Thermo Fisher公司;Milli-Q超纯水仪:美国Millipore公司;Rotina380R高速离心机:德国Hettich公司;ML802/02电子天平:梅特勒仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 离子色谱条件

AS11-HC阴离子分离柱(4 mm×250 mm),AG11-HC保护柱(4 mm×50 mm);淋洗液:KOH溶液;淋洗方式:多级梯度淋洗;电导检测器检测;流速1.00 mL/min;柱温30℃;进样量50 μL。

1.3.2 样品前处理

使用2.0 mol/L KOH溶液,调节样品pH值至5.2～6.5,取10.0 mL样品放入50 mL离心管中,在10 000 r/min条件下离心15 min,取上清液0.50 mL至100 mL容量瓶中,超纯水定容至刻度,摇匀并静置10min,取10.0mL溶液,过0.22 μm水相过滤膜,弃去前面3 mL,收集后面清液,上机检测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

依次进行了AS11、AS11-HC、AS19三种色谱柱分离对比实验。AS11-HC是一种高容量、强亲水性色谱柱,尤其适用于食品中多种有机酸和阴离子同时测定。实验结果也证实,采用AS11-HC色谱柱组分灵敏度高、峰型较尖锐。因此,选择AS11-HC色谱柱进行实验。

2.1.2 流速的选择

对比了0.50 mL/min、0.75 mL/min、1.00 mL/min、1.25 mL/min、1.50 mL/min五种流速条件下分离情况。在0.50mL/min和0.75 mL/min流速时,流速低、压力小、峰宽较大,出峰时间较长,灵敏度不高。1.25mL/min和1.50 mL/min流速时系统压力较高,直接影响色谱柱使用寿命。1.00mL/min时,压力适中,灵敏度高,总出峰时间缩至32min。综合考虑各种因素,选择1.00 mL/min为实验流速。

2.1.3 pH值的选择

由图1可知,26种组分中有一些不稳定的有机酸和阴离子,如和离子,受溶液pH值影响较大,当pH值＜4.0时检测浓度低于理论浓度的80%。为了验证pH值对组分测定的影响,以KOH溶液来配制一系列不同pH值(2.6、3.5、4.5、5.7、6.8、8.5、10.1、11.6)的去离子水溶液,然后将相同理论浓度混合标准溶液配置成不同的pH值,测定不同pH值条件下26种组分测定含量的变化。实验结果证实,pH＜5.0时,不稳定的有机酸和阴离子测定含量降低,pH为5.5～6.8时,多数组分测定结果稳定、灵敏度高。这是由于多数有机酸的解离常数pKa值在4.2～6.5,当pKa值与pH值相等时,溶液中的中性分子和离子型分子的浓度相同,组分处于相对稳定的状态,适于定性定量分析。图1中是受pH值影响较大的7种组分的检测分析图谱,结果表明,在pH值为5.2～6.7左右,检测组分含量稳定,因此,选择pH值为5.2～6.5进行实验。

图1 溶液pH值对有机酸和阴离子检测的影响Fig.1 Effect of solution pH value on determination of organic acids and anions

2.1.4 梯度淋洗条件的选择

离子色谱多级梯度淋洗条件见表1,26种组分混合标准溶液的离子色谱图见图2。

表1 离子色谱多级梯度淋洗条件Table 1 Multistage gradient elution conditions of ion chromatography

图2 26种组分混合标准溶液的离子色谱图Fig.2 Ion chromatogram of mixed standard solution of 26 components

由表1及图2可知,26种组分中某些组分结构相似、分子质量相近、出峰时间接近,一般梯度淋洗条件难以分离。为了便于分析,根据组分在色谱柱上保留特性,将26种组分分为3类:弱保留组分(1～13)、中等保留组分(14～21)、强保留组分(22～26)。

0～6min是初始淋洗浓度时间段,依次进行了0.80mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L初始浓度条件下的实验。0.80 mmol/L浓度下,组分出峰时间拖后,总出峰时间变长,且前3种弱保留组分的分离度不好;1.25 mmol/L浓度时,前10种弱保留组分总体分离效果不佳;初始浓度为1.00 mmol/L时,26种组分色谱峰的分离状况理想。因此,选择1.00 mmol/L为初始淋洗浓度。

在6～22min时间段,有21种待测组分,先后进行了30多次实验分析,最终选择使用3次淋洗浓度和淋洗斜率变化。首先,在6～13 min时,淋洗斜率为1.857 mmol/(L·min);在13～17 min时,淋洗浓度由14.00 mmol/L增至14.50 mmol/L,此时几乎是一个等度淋洗浓度,便于结构性能相近组分的分离;在17～22 min时,淋洗浓度由14.50 mmol/L增至18.00 mmol/L,淋洗斜率为0.700 mmol/(L·min)。在多级梯度淋洗条件下,多组分灵敏度高、分离效果好。

在22～33min时,进行了最高淋洗浓度分别为50mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L条件下对比分析实验。结果证实,在50mmol/L浓度时,5种强保留组分出峰时间拖长,且灵敏度不高;在70mmol/L浓度时,5种组分出峰速度快、灵敏度高,但分离度变小、组分峰有重叠情况;最高淋洗浓度为60mmol/L时,5种强保留组分灵敏度和分离度较好,因此,选择此浓度进行实验。

时间段的划分、初始浓度、淋洗斜率大小、最高淋洗浓度都是分离测定的重要影响因素,在实际操作中,应该全面系统地分析,科学合理地选择。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围与检出限

在0.02～2.00 mg/L质量浓度范围内,进行了7个不同浓度水平(0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L)标准工作液的测定,以组分质量浓度(X)为横坐标,以组分峰面积(Y)为纵坐标,进行标准曲线线性拟合,结果见表2。由表2可知,26种组分线性相关系数R均＞0.99,线性良好;个别有机酸因自身不稳定或分离度不高,线性相关性不理想;除了苯甲酸检出限为0.217 6 mg/L外,25种组分检出限在0.000 1～0.072 8 mg/L。

表2 测定组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(S/N=3)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and detection limit of components determined

2.2.2 回收率实验

在白酒样品中依次进行了0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L 3个浓度添加水平下的回收率测定实验,来验证方法的准确度,结果见表3。

表3 回收率实验结果Table 3 Results of recovery rate tests

由表3可知,26种组分测定回收率为73.50%～115.13%,回收率结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在1.07%～10.23%范围内,从回收率大小来看,仅有在0.50 mg/L和1.00 mg/L添加水平下,奎尼酸、苯甲酸、顺乌头酸三种物质回收率＜80.0%,1.00 mg/L添加水平下的甲酸回收率＞110%,其他均处于80%～110%范围内;从精密度RSD结果来看,奎尼酸和甲酸RSD偏大,其他RSD均＜8.00%。这说明白酒中26种组分用该法测定时,精密度和准确度较好。

2.2.3 精密度实验

选取一种代表性白酒样品,进行6次平行测定,并计算结果相对标准偏差,结果见表4。

表4 精密度实验结果Table 4 Results of precision tests

由表4可知,白酒中检出的6种组分6次平行测定实验结果相对标准偏差在3.38%～4.97%范围内。测定精密度结果符合检测技术要求,说明该检测方法精密度良好。

2.3 实际样品测定

白酒中有机酸是其重要呈味物质,主要有乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等,此外还可能含有极少量辛酸和庚酸。取5种白酒用该法进行26种组分测定,其离子色谱图见图3,各组分测定结果见表5。

图3 5种白酒样品中有机酸和阴离子检测离子色谱图Fig.3 Ion chromatogram of determination of organic acids and anions in fiveBaijiusamples

由图3可知,在6.5 min出现了一个蘑菇包型色谱峰,这是白酒中乙醇的色谱峰,会在一定程度上影响奎宁酸(出峰时间8.35 min)的定量;白酒中主要有机酸是乳酸和乙酸,乳酸是酿酒发酵过程产生的,且可以与乙醇产生乳酸乙酯,是白酒呈香味的重要物质,其含量大小是白酒质量的一个重要标志。1、2、4号白酒中乳酸含量较高,且总体有机酸种类丰富、含量较高,说明酒体质量较高,这3种酒市场价格高,也恰好印证该结论。而3、5号白酒的乳酸含量较低,有机酸总体含量低,且5号白酒检出有害离子NO2-,酒体质量相对不高。有4种白酒在15.0 min出现了一个色谱峰,经单标确认为己酸色谱峰。从图3可看出,虽然白酒样品测定时有高含量的乙醇干扰,含量较高的乙酸和乳酸分离度不够高,但是总体基线平稳,各组分色谱峰形尖锐,多数色谱峰分离度较理想,说明检测方法稳定、实用。

表5 5种白酒样品中26种组分测定结果Table 5 Determination results of 26 components in fiveBaijiusamples

由表5可知,5种白酒中各种有机酸含量大小不一,5种白酒中检出的有机酸有乳酸、乙酸、甲酸、丁酸、戊酸、马来酸、顺乌头酸、反乌头酸,其中含量最大3种有机酸分别是乳酸(0.494 4～4.060 4 mg/L)、乙酸(3.007 9～5.497 8 mg/L)、马来酸(0.951 7～1.673 2 mg/L),而D-奎尼酸、丙酸、丙酮酸、戊二酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、富马酸、苯甲酸、柠檬酸未检出;检出的无机阴离子有Cl-(0.085～0.395mg/L)、NO2-、PO43-,而其他5种阴离子未检出。

3 结论

本研究通过对流速、溶液pH值、初始梯度浓度、淋洗斜率等多种实验影响因素的分析,确定了白酒中26种组分分离的梯度淋洗条件,建立了离子色谱法快速测定白酒中26种有机酸和阴离子的方法。结果表明,流速为1.00mL/min,pH值为5.3～6.0,初始淋洗浓度为1.00 mmol/L,最高淋洗浓度为60 mmol/L时,26种组分分离效果理想。本方法操作快速便捷、灵敏度高、适用性强,经简单前处理后即可上机测定,32 min内26种组分全部出峰,完全适于白酒中26种有机酸和阴离子的快速测定。

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SONG Weide1,LI Zhaojie2,YANG Liming1,WANG Kai1,GAO Yaohua1,LI Linjie1,JIANG Weizhen1
(1.Rizhao Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Rizhao 276826,China;2.Weihai Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Weihai 264200,China)

O657.7

0254-5071(2017)11-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.033

2017-08-08

山东出入境检验检疫局科技项目(SK201619);国家质检总局科技项目(2017IK220,2015IK204)

宋卫得(1981-),高级工程师,硕士,研究方向为食品安全检测技术。