微生物转化人参皂苷Re为人参皂苷Rh1的研究

张丽娜,明有山,曲波权,全艳玲,丛景香,吴秀红*

(辽宁科技大学 化学工程学院,辽宁 鞍山 114000)

微生物转化人参皂苷Re为人参皂苷Rh1的研究

张丽娜,明有山,曲波权,全艳玲,丛景香,吴秀红*

(辽宁科技大学 化学工程学院,辽宁 鞍山 114000)

人参皂苷Re是人参的主要药理活性成分,具有抑制癌细胞增长、阻止癌细胞转移及保护神经等重要生理作用,稀有人参皂苷Rh1在抗癌方面的疗效更为显著。为获得较高含量的Rh1,微生物转化是目前较为有效途径。该研究从人参种植土中筛选可转化常量人参皂苷Re为稀有人参皂苷Rh1的目的菌株S329,以西洋参提取物为反应底物进行微生物发酵实验,利用高效液相色谱(HPLC)法对人参皂苷Re及其发酵产物进行分析。结果表明,通过对菌株形态学观察和18S rDNA测序分析,且通过在NCBI数据库上的Blast比对分析,鉴定高效菌株S329属于溜曲霉(Aspergillus tamarii),人参皂苷Re转化人参皂苷Rh1的转化率为27.65%。

人参皂苷Re;人参皂苷Rh1;发酵;菌株筛选;微生物转化

人参具有延缓衰老、益智益肺、滋补强壮和抗肿瘤等药理活性,被用于治疗多种疾病已有几千年的历史,此外,人参也被广泛应用于制药、化妆品等商业化领域[1-3]。最常见的人参种类有人参、三七和西洋参等。人参皂苷是人参的主要药理活性成分,是一种以糖苷配基为主链,多糖、氨基酸、类黄酮为侧链的多萜类物质[4-6],可以分为二醇型、三醇型、齐墩果酸和拟人参皂苷元。人参皂苷因结构不同,而具有不同的药理活性[7]。稀有人参皂苷药理活性明显高于常量人参皂苷,如人参皂苷Rh1和Rh2在抑制各种肿瘤细胞增长方面效果显著,而在人参中含量仅为万分之一和不到十万分之二[8-10]。因此,在人参中直接提取稀有皂苷用于医学治疗是很不经济的。

分析稀有人参皂苷和常量人参皂苷结构,发现通过改变β-葡萄糖分子[11-12]的数量和位置,可以实现常量人参皂苷转化稀有人参皂苷,常见方法有化学合成,弱酸、弱碱的解离,生物转化和酶转化法[13-14]。化学法常伴随羟基化和差向异构化产物,且大量使用有机溶剂对环境不利;酶转化法和生物转化法条件温和、转化率较高、环境友好、产物单一,更适合工业生产。目前利用微生物转化研究稀有人参皂苷已有报道,并已用于制备稀有人参皂苷[15-18]。

基于微生物在生物转化方面的研究与应用,本研究主要从人参种植土中筛选可以转化人参皂苷Rh1的菌株,将常量人参皂苷Re微生物转化为稀有人参皂苷Rh1,并采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法进行发酵产物检测,并对筛选菌株进行形态学观察和分子生物学鉴定。所得菌株可高效转化人参皂苷Re,为扩大人参皂苷在医药领域和规模化生产中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西洋参粗提物(含10%人参皂苷Re):陕西天之润科技有限公司;体积分数为95%乙醇(分析纯):沈阳市新东试剂厂;乙腈(色谱纯):美国TEADE科技有限公司;葡萄糖(分析纯)、硫酸亚铁(分析纯):北京化工厂;蛋白胨(生化试剂):北京奥博星生物技术有限公司;磷酸氢二钾(分析纯):天津市汉沽区滨海福利化工厂;硫酸镁(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;琼脂(生化试剂):福建泉州市泉港化工厂;硝酸钠(分析纯):沈阳市试剂一厂;硅胶(80-120目):青岛海洋化工;人参皂苷Re、人参皂苷Rh1:中国药品生物制品检定所;人参种植土:吉林松原人参种植土。

马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA)培养基:马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂20 g/L。

种子培养基(PDA培养基):马铃薯20g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨10 g/L。

发酵培养基:NaNO31.5g/L,蛋白胨1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,K2HPO41.0 g/L,FeSO40.1 g/L,加入质量分数为50%Re作为发酵底物,pH为中性。

上述培养基均在121℃下进行高温湿法灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪:美国Agilent科技有限公司;GR-202电子分析天平:日本AND公司;B-30立式压力蒸汽灭菌器:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-5超净工作台:上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司;LRH-250A生化培养箱:广东医疗器械厂;RE-2000E旋转蒸发仪:巩义市予华仪器有限责任公司;BSD-150空气振荡培养箱:上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 硅胶柱分离人参皂苷Re

称取2.000 g西洋参提取物(含质量分数为10%的人参皂苷Re),充分溶解于少量甲醇中,加入6.000 g硅胶,不断搅拌,水浴蒸干,蒸干后的样品用研钵将其研磨,制成样品胶待用。称取适量硅胶装入玻璃柱内,再铺一层定量滤纸及海沙;将样品胶置于硅胶柱顶部,以氯仿∶甲醇=9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9(V/V)的洗脱液依次洗脱,各梯度洗脱液为50 mL,收集柱后馏分。将含有Re的馏分段进行浓缩,用高效液相色谱检测分析,制得人参皂苷Re的质量百分数为50%,以此作为微生物转化的底物。

1.3.2 菌株分离

配制1 g/L的人参种植土溶液,依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍,在无菌操作条件下,分别将不同浓度的人参种植土溶液加到装有PDA培养基的平板上,置于28℃恒温培养箱中培养3～7 d。

在无菌操作条件下,把生长状态较好的孢子小心地用接种针挑出,在已经灭菌的平板固体培养基中划线,重复划线几次,每个菌株接两个,在28℃的培养箱中培养3～7d,培养好后观察,若纯化的培养基中还有其他菌株,则用同样的方法操作,直到培养基中只有单一菌株菌落为止。

在无菌条件下,将分离纯化好的菌株接种到斜面固体培养基,置于28℃培养箱内,培养3～7 d,待菌丝长满斜面,即可将纯化的菌株放入冰箱保存。

1.3.3 种子液的制备

在无菌条件下将斜面培养基中孢子接种到种子液中,置于28℃、转速为160 r/min的空气振荡培养箱中培养3 d,待长出菌丝球进行转化实验。

1.3.4 人参皂苷生物转化

发酵液培养基按装液量30 mL/50 mL高压灭菌,冷却至室温,在无菌操作条件下,将4 mL种子液的菌丝球接种到发酵液中,置于28℃、转速为160 r/min的空气振荡培养箱中培养6 d。离心,过滤,利用高效液相色谱分析发酵液中的稀有人参皂苷Rh1的含量。

1.3.5 高效液相色谱分析条件

UG80-CAPCELL PAK NH2色谱柱(5 μm,4.6 mm×250mm),乙腈∶水(10∶90,V/V)为流动相,流速为0.8mL/min,柱温为30.0℃,紫外检测波长为203 nm,进样量为20 μL。在此色谱条件下,按照人参皂苷Re和Rh1对照品的保留时间分别作为人参皂苷Re和Rh1的定性依据。人参皂苷Re和Rh1对照品的质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,绘制人参皂苷Re和Rh1标准曲线,其线性回归方程分别为y=6.3794x+20.419(R=0.9994)、y=3.6225x-50.125(R=0.9998),以此进行人参皂苷Re和Rh1的定量分析。

1.3.6 菌株的形态学观察和18S rDNA序列鉴定

在显微镜下观察高效菌株的形态特征。高效菌株委托上海生工生物工程股份有限公司测序。将取出的菌株基因组DNA为模板,采用NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS(GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC)作为一对引物,进行特异性扩增,扩增产物长度约为1 189 bp。将聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)产物用1%琼脂糖进行电泳(150 V、100 mA)分析,然后进行基因序列对比分析。

1.3.7 转化率计算公式

式中:A为转化率,%;其中c1为发酵液中人参皂苷Rh1的质量浓度,mg/L;V1为发酵后发酵液的体积,mL;c0为空白对照发酵液中人参皂苷Re的质量浓度,mg/L;V0为空白对照发酵液体积,mL。

2 结果与分析

2.1 高效菌株的形态学观察和基因组分类测序分析

2.1.1 菌株形态学观察

将分离纯化的高效菌株S329经PDA培养基培养,并在显微镜下观察菌株S329形态特征,结果见图1。

图1 分离菌株S329的菌落形态(A)及孢子形态(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and spore morphology(B)of the isolated strain S329

图1 A可知,分离菌株S329呈铺开式生长,中央部分稍现絮状,初为黄绿色,后呈深棕褐色。由图1B可知,在显微镜下可观察到菌株S329分生孢子呈球形,直径为180 μm;小顶囊呈球形,直径为80 μm,可观察到足细胞,初步确认该高效菌株S329为多细胞的曲霉属(Aspergillus)。

2.1.2 分离菌株分子生物学鉴定

对分离菌株S329进行分子生物学鉴定,将测得的18S rDNA基因序列与GenBank中核酸数据库进行对比分析,找到与测得的菌株同源性相近的属,再利用DNAstar软件构建系统发育树,结果如图2所示。

图2 分离菌株S329系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated strain S329

由图2可知,分离菌株S329与溜曲霉(Aspergillustamarii)ZJUT ZQ013的相似度为100%,鉴定分离菌株S329为溜曲霉(Aspergillus tamarii)。

2.2 HPLC检测分析人参皂苷

在1.3.5高效液相色谱分析条件下分析发酵液中人参皂苷Re和Rh1含量,并与人参皂苷Re和Rh1对照品色谱图对比分析,结果如图3所示。

在此色谱条件下,人参皂苷Re和Rh1的保留时间分别为8.125 min和21.773 min,分别以以人参皂苷Re和Rh1对照品的出峰时间相比较,作为人参皂苷Re和Rh1的定性依据。由图3(a)可知,发酵前人参皂苷Rh1含量很少,经28℃、160 r/min摇床发酵6 d后,由图3(b)可知,Re含量明显减小,Rh1含量大大增加,由标准曲线线性回归方程计算发酵前后Re和Rh1含量变化。人参皂苷Re转化为Rh1的转化率为27.65%,优于现有研究报道[19]。

图3 发酵液发酵前(a)、发酵后(b)以及人参皂苷标品(c)的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of fermentation liquid before fermentation(a),after fermentation(b)and ginsenoside standard(c)

3 结论

从人参种植土中筛取的高效菌株经生态学观察和分子学鉴定分析确定为溜曲霉(Aspergillus tamarii)ZJUT ZQ013,在最优发酵条件下可转化常量人参皂苷Re为稀有人参皂苷Rh1,转化率为27.65%,稀有人参皂苷Rh1在西洋参和人参中含量为0.01%,结果表明高效发酵后所得菌株Rh1量是人参中含量的约2 700倍。为进一步分离制备稀有人参皂苷Rh1提供了基础。

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ZHANG Lina,MING Youshan,QU Boquan,QUAN Yanling,CONG Jingxiang,WU Xiuhong*
(School of Chemical and Engineering,University of Science and Technology Liaoning,Anshan 114000,China)

Q33

0254-5071(2017)11-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.025

2017-08-14

辽宁省教育厅项目(L2014106)

张丽娜(1991-),女,硕士研究生,研究方向为天然药物的分离。

*通讯作者:吴秀红(1968-),女,教授,博士,研究方向为天然药物制备与分离。