酵母菌FW-sc-08的生长及发酵特性研究

2017-12-06李亚辉周剑忠朱佳娜

中国酿造 2017年11期

关键词：黑莓果酒酒精度

李亚辉,周剑忠*,王英,朱佳娜

(江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014)

酵母菌FW-sc-08的生长及发酵特性研究

李亚辉,周剑忠*,王英,朱佳娜

(江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014)

通过对影响菌体生长因素、发酵指标和香气成分的测定,研究了从自然发酵黑莓酒中筛选出的酵母菌FW-sc-08的生长和发酵特性。结果显示,酵母菌FM-sc-08对数生长期为3～9 h,对SO2最大耐受质量浓度为800 mg/L;酵母菌FM-sc-08适宜发酵的可发酵糖最大含量为30%,对糖最大耐受量为40%,可发酵酒精度最高16.3%vol。通过测定不同温度对发酵指标的影响,最终确定酵母菌FM-sc-08的最适发酵温度为25℃;对比20℃和25℃发酵的黑莓果酒酒样中的香气成分,可知酵母菌FM-sc-08在20℃发酵黑莓酒产香气成分较多(35种)。

黑莓酒;酵母菌FM-sc-08;生长特性;发酵特性

黑莓(blackberry),又名覆盆子,属于蔷薇科(Rasaceae)悬钩子属(Rubrs),实心莓亚属(Eubatus),是多年生灌木小浆果[1]。黑莓起源于欧洲和北美,于20世纪80年代由江苏省中科院植物研究所引入中国。江苏省是我国黑莓主要种植地,面积约占我国种植面积的约80%[2-3]。黑莓果实营养物质丰富,具有较高的营养价值,被誉为“黄金水果”和“生命之果”等[4-5]。黑莓酒是以黑莓为原料的酒类制品,其不仅最大限度地保留了黑莓果实中的营养成分和保健功能因子,而且通过生物发酵还产生了大量生物活性物质,长期饮用具有美容养颜、降血压、降血脂、保护血管、减缓衰老等多种功效[6-8]。但黑莓酒中有机酸含量高,口感较差,难以被人们接受,严重影响了黑莓酒的品质和市场发展[9]。黑莓酒中最主要的有机酸是苹果酸,苹果酸是一种具有强烈辛酸味的双羧基酸,口感较差[10-11]。如何降低黑莓酒中有机酸含量和酸度,是目前生产企业和科研人员关注的问题[12]。

降酸处理是很多果酒酿造中必不可少的步骤,对新生果酒进行降酸处理主要通过物理、化学和生物降酸等方法来实现[13-15]。物理降酸法在实际生产中耗时长且成本高;化学降酸法降酸效果好,但易导致酒体失去平衡;生物降酸法是通过微生物将二元酸转化为一元酸,从而达到降酸目的[16-19]。生物降酸又称苹果酸乳酸发酵,此法效率高、成本低、无污染、降酸效果好,还能增加果酒的香气物质、改善果酒的风味[20-21]。因此生物降酸是目前果酒酿造中首选的降酸方法,也是果酒发酵领域研究的热点[22]。

为了解决黑莓酒酸度较高的问题,本课题组从自然发酵黑莓果酒中分离出各类形态不同的酵母,通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)对有机酸测定,筛选出1株具有良好苹果酸降解性能的菌株FW-sc-08,通过生理生化及分子生物学鉴定,该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[12]。本研究在前期研究基础上,对筛选出的S.cerevisiaeFW-sc-08的生长和发酵特性,以及其对黑莓酒风味的影响进行了系统研究。以期优化黑莓酒发酵工艺、改善黑莓酒口感、提高黑莓酒整体品质、促进黑莓酒产业的发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑莓:江苏省溧水区黑莓基地;酵母菌FW-sc-08:本实验室从自然发酵黑莓酒中筛选得到。

柠檬酸、偏重亚硫酸钾(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;果胶酶(4 000 U/g)、果浆酶(3 000 U/g):诺维信生物技术有限公司;酚酞、蒽酮(均为分析纯):上海浦口化学试剂有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基:广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SJ-CJ-2FQ洁净工作台:苏州安泰空气技术有限公司;LRH-150生化培养箱:上海一恒科技有限公司;THZ-C-1台式冷冻恒温振荡机:太仓市实验设备厂;SevenEasyplus pH仪:梅特勒-托利多仪器上海有限公司;TGL-16C台式离心机:上海安亭科学仪器厂;YXYQ型水浴锅:常州国华电器有限公司;723型可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;XPE电子分析天平:浙江凯丰集团有限公司;SPX-200电热干燥培养箱:南京实验仪器厂;TRACE气相色谱-质谱联用仪(gas chromatogram-mass spectrometry,GC-MS):美国Finnigan公司;Supeclo-24固相微萃取装置及萃取头(50/30 mDvB,CAR/PDMS):美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株FW-sc-08生长特性测定

菌株生长曲线绘制:将活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接种量接种于PDA液体培养基中,于25℃恒温培养,每3 h取样一次,在波长600 nm处测菌液吸光度值(OD600nm),绘制菌株生长曲线。

菌株酸耐受性测定:将活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接种量分别接种于pH值为1.5、2.0、2.5、3.0和3.5的PDA液体培养基中,以自然pH(4.5)PDA液体培养基培养组为对照,于25℃恒温培养,每3 h取样一次,在波长600 nm处测菌液吸光度值(OD600nm)。

菌株SO2耐受性测定:将活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接种量分别接种于SO2质量浓度为500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L和900 mg/L的PDA液体培养基中(以偏重亚硫酸钾形式加入),以不添加SO2的PDA液体培养基对照,于25℃恒温培养,每3 h取样一次,在波长600 nm处测菌液吸光度值(OD600nm)。

1.3.2 黑莓果酒制作工艺流程和操作要点

操作要点:将黑莓果实打浆后,加入0.25%果胶酶和0.25%果浆酶,40℃酶解4～5 h,过滤,添加0.005%二氧化硫(加入0.01%偏重亚硫酸钾)搅拌均匀,按照0.5%接种量接入菌株FM-sc-08,添加一定量的蔗糖后,25℃发酵,当残糖含量＜4 g/L时即表示发酵结束,发酵结束后立即分离,自然澄清15～20d后,用硅藻土下胶,然后在0℃冷冻处理,最后用0.45 μm膜过滤后灌装。

1.3.3 菌株FW-sc-08发酵特性测定

菌株可发酵糖含量测定:按1.3.2工艺操作要点,分别按25%、30%、35%、40%添加量加蔗糖后发酵,每天取样品分别测定发酵液残糖含量。

菌株发酵酒精度测定:按1.3.2工艺操作要点,先加糖15%进行发酵,然后每天添加5%的蔗糖,同时每天取样测定残糖含量,直至被发酵的糖总量稳定为止,此时测定黑莓果酒酒精度。

不同温度下发酵指标测定:按照1.3.2工艺操作要点,添加20%的蔗糖,然后分别在10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下进行恒温发酵,每天取样测定其总酸、总糖含量和pH;当发酵至残糖含量＜0.4%时,取样测定发酵液总SO2、游离SO2含量和酒精度。

1.3.4 理化指标检测方法

残糖含量:参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定;pH值:采用pH仪进行测定;总酸、总糖、总SO2、游离SO2和酒精度测定参照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。

1.3.5 菌株FW-sc-08发酵黑莓果酒香气成分测定

香气成分的提取:按照1.3.2所述发酵工艺流程,分别在20℃和25℃进行恒温发酵,发酵结束后取样进行香气成分分析,以黑莓汁作为对照。取20℃和25℃发酵的黑莓果酒酒样及黑莓汁各2.5 mL,分别加入到10 mL顶空瓶中,加入0.75 g NaCl溶解,于40℃条件下萃取40 min。萃取后,在进样口温度250℃解吸10 min。

气相色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度250℃,程序升温40℃,保持5 min,以10℃/min升温到250℃,保持10 min;传输线温度280℃,载气高纯氦气(He)(99.999%),进样量0.3 μL,载气流速1.0 mL/min[23]。

质谱条件:电离方式为电子电离(electronionization,EI)源,电子能量70 eV,离子源温度230℃,四级杆温度150℃,扫描范围35～500u,对采集到的质谱图利用NIST 08.L谱库进行检索,并采用气相色谱峰面积归一化法定量计算出各香气成分的相对含量。

1.3.6 数据分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0数据处理软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株FW-sc-08生长特性

2.1.1 菌株生长曲线测定

由图1可知,菌株FM-sc-08在PDA液体培养基中生长良好,延滞期较短,很快进入对数生长期,3～9 h为对数生长期,9～18 h为稳定期,18 h以后时进入衰亡期。

图1 酵母菌FM-sc-08菌株生长曲线Fig.1 Growth curve ofS.cerevisiaeFM-sc-08

2.1.2 菌株酸耐受性测定

图2 不同pH值对酵母菌FM-sc-08生长的影响Fig.2 Effects of different pH value on growth of S.cerevisiaeFM-sc-08

菌株FM-sc-08的酸耐受性试验检测结果如图2所示。由图2可知,在对照组(pH 4.5)和试验组pH 3.5条件下,菌体OD600nm值迅速上升,且明显高于其他试验组,说明菌体FM-sc-08生长良好;当培养基pH值分别为3.0和2.5时,菌体生长缓慢,生长曲线明显出现滞后现象,延滞期和对数生长期明显延长,且pH越低滞后现象越严重;在pH 2.0和pH 1.5条件下菌体几乎没有生长。因此,菌株FM-sc-08可耐受pH3.5的酸性环境。

2.1.3 菌株SO2耐受性测定

酵母菌FM-sc-08的SO2耐受性试验结果如图3所示。由图3可知,对照组菌体生长良好;当SO2质量浓度为500～800 mg/L时,菌体生长缓慢,生长曲线明显出现滞后现象,延滞期和对数生长期明显延长,且随着SO2质量浓度的增加,生长越来越慢,滞后现象越来越严重;当SO2质量浓度为900 mg/L时,菌体几乎没有生长。因此,菌株FM-sc-08对SO2的最大耐受质量浓度为800 mg/L。

图3 不同SO2质量浓度对酵母菌FM-sc-08生长的影响Fig.3 Effects of different concentration of SO2on growth of S.cerevisiaeFM-sc-08

2.2 菌株FW-sc-08发酵特性

2.2.1 可发酵糖含量的测定

菌株FM-sc-08发酵黑莓酒可发酵糖含量测定结果如表1所示。由表1可知,当蔗糖添加量为25%、30%、35%和40%时黑莓发酵液中残糖含量分别为(30.66±2.02)%、(35.69±3.02)%、(40.08±3.65)%和(44.89±4.23)%,说明黑莓果汁中原有蔗糖含量约为5%。当蔗糖添加量为25%时,发酵10 d后,残糖含量降至(0.45±0.04)%,蔗糖消耗量为30.21%,说明发酵完全;当蔗糖添加量为30%、35%和40%时,残糖量分别在发酵8 d、9 d和4 d后趋于稳定,分别约为6%、10%和20%,蔗糖消耗量分别约为30%、30%和25%。表明蔗糖添加量为25%、30%和35%时,最终蔗糖消耗量均约为30%,当添加量为40%时,蔗糖消耗量下降,说明酵母菌FM-sc-08在发酵中可发酵糖的最大量约为30%。

表1 酵母菌FM-sc-08可发酵糖含量检测结果Table 1 Determination results of fermentable sugar contents byS.cerevisiae FM-sc-08

2.2.2 菌株发酵产酒精测定

酵母菌FM-sc-08发酵产酒精测定结果如表2所示。由表2可知,发酵至第7天时添加蔗糖5%后,残糖含量为19.82%,比第6天的残糖含量多约5%,说明此时糖已基本不再被消耗,且第8、9和10天不再加糖,残糖含量保持不变,说明第6天时发酵已完全;随着发酵时间的延长,酒精度逐渐上升,从第6天开始趋于稳定,基本维持在16.1%vol左右,进一步说明第6天时发酵已结束。表明酵母菌FM-sc-08可发酵产生酒精度最大为16.3%vol,发酵时间为6 d。

表2 酵母菌FM-sc-08的可发酵酒精检测结果Table 2 Determination results of ethanol content byS.cerevisiae FM-sc-08

2.2.3 不同温度下发酵指标测定

酵母菌FM-sc-08在不同温度下发酵生产黑莓果酒,残糖含量变化如图4所示。由图4可知,随着发酵温度的升高,发酵速度逐渐加快;当发酵温度为10℃时,残糖含量下降较小,说明发酵基本不进行;当发酵温度为15℃时,残糖含量下降缓慢,发酵至16 d时,残糖含量为12.4%,说明发酵速度较慢;当发酵温度为20℃时,残糖含量明显下降,发酵至第12天时,残糖含量约为0.5%,表明发酵基本完全;当发酵温度为25℃时,残糖含量有较为明显下降,发酵至第10天时,残糖含量约0.6%,表明发酵基本完全;当发酵温度为30℃时,残糖含量下降最快,发酵至第8天时,残糖含量约0.8%,表明发酵基本完全,但与25℃相比相同发酵时间点残糖含量没有较大差异。因此,菌株FM-sc-08最适宜发酵温度为25℃。

图4 不同温度下黑莓果酒发酵过程中残糖含量的变化Fig.4 Changes of residual sugar content during fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同温度下发酵生产黑莓果酒,pH值变化如图5所示。由图5可知,当发酵温度为10℃和15℃时,发酵液pH值变化不大,当发酵温度为20℃、25℃和30℃时,发酵液pH值均有明显的上升,从2.68逐渐上升到3.30左右,其中发酵温度为25℃和30℃时变化最为明显。因此,最适宜发酵温度为25℃。

图5 不同温度下发酵pH值的变化Fig.5 Changes of pH value during fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同温度下发酵生产黑莓果酒,总酸含量变化如图6所示。由图6可知,在不同温度下发酵,黑莓果酒总酸含量呈现出下降趋势。当发酵温度为10℃和15℃时,发酵液总酸含量有较小的下降;当发酵温度为20℃、25℃和30℃时,总酸含量有明显的下降。在25℃和30℃时总酸含量下降最多,且在两个温度下没有显著差异。因此,最适宜发酵温度为25℃。

图6 不同温度下发酵总酸含量的变化Fig.6 Changes of total acid contents during fermentation at different temperatures

表3 不同温度发酵后黑莓果酒中SO2含量和酒精度测定Table 3 Determination of SO2and alcohol contents after fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同温度下发酵生产黑莓酒,发酵结束后SO2含量和酒精度测定结果如表3所示。由表3可知,随着发酵温度的升高,总SO2和游离SO2含量都逐渐降低,游离SO2含量约为总SO2含量的2/3。这说明在较高温度下发酵,发酵结束后要及时补加一定量的SO2,以防止被杂菌感染。在发酵温度为10℃时发酵几乎没有进行,在发酵温度为15℃和20℃时,发酵速度缓慢,但最终酒精度较高;在发酵温度为25℃和30℃时,发酵速度较快,但最终酒精度和在15℃和20℃下发酵相比偏低。此结果说明FM-sc-08在低温(15～20℃)下发酵可使发酵更完全、更彻底、酒精度更高。

2.3 酵母菌FW-sc-08发酵所产黑莓果酒香气成分分析

挥发性香气物质是葡萄酒和其他果酒的重要组成成分,是形成果酒不同风味的重要物质和果酒感官评价的重要指标[24-25]。酵母菌FM-sc-08在20℃和25℃发酵所产黑莓果酒香气成分测定结果如表4所示。由表4可知,共检测出44种挥发性物质,其中在20℃发酵条件下检测出35种,在25℃发酵条件下检测出29种,这些挥发性物质主要为醇类、酮类,醛类、酸类和酯类;与在25℃发酵相比,在20℃发酵,有30种香气物质相对含量明显升高,14种香气物质相对含量下降。结果说明,与在25℃发酵相比,酵母菌FM-sc-08在20℃发酵生产黑莓酒,可产生更多的挥发性物质,使果酒风味更丰富。这可能是因为在低温下发酵浸渍时间更长,香气物质溶出更多且保留更多,高温下发酵香气成分挥发较多造成的。

表4 酵母菌FW-sc-08发酵黑莓果酒香气成分分析Table 4 Analysis of blackberry wine aroma components fermented by S.cerevisiae FM-sc-08

续表

3 结论

本试验对从自然发酵黑莓酒中筛选出的酵母菌FW-sc-08的生长和发酵特性进行了研究。结果显示,酵母菌FM-sc-08对数生长期为3～9 h;在pH2.0～3.5内随着培养基pH的降低生长逐渐变慢;其对SO2的最大耐受质量浓度为800mg/L。在黑莓酒发酵中,酵母菌FM-sc-08可发酵糖最大含量为30%,对糖的最大耐受含量为40%,发酵产酒精度最高为16.3%vol,发酵时间为6 d;最适发酵温度为25℃。酵母菌FM-sc-08在20℃下发酵黑莓酒可产生比在25℃下发酵更多的香气物质(35种)。这对优化黑莓酒发酵工艺、提高黑莓酒整体品质具有重要意义。

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