RAFT沉淀法制备杀虫脒分子印迹聚合物及其应用

马鹏飞，韩生华

（山西大同大学化学与环境工程学院，山西省大同市 037009）

RAFT沉淀法制备杀虫脒分子印迹聚合物及其应用

马鹏飞，韩生华

（山西大同大学化学与环境工程学院，山西省大同市 037009）

采用可逆加成-断裂链转移技术结合分子印迹沉淀聚合法，以杀虫脒（CD）为模板分子，二苄基三硫代碳酸酯（DBTTC）为试剂，制备CD印迹聚合物（R-MIP）。考察了溶剂及单体与偶氮二异丁腈和DBTTC的比例对聚合物形貌的影响，并对其吸附性能进行了研究。结果表明：条件优化后制备的R-MIP微球粒径均一，分散性好，对目标分子有良好的特异识别性，且吸附量高于传统法；将其作为固相萃取填料，结合高效液相色谱法对蜂蜜中CD进行分离，富集，检测，加标回收率为88.3%～99.2%，相对标准偏差小于 4.7%，测定下限为0.37 µg/kg。

分子印迹聚合物 可逆加成-断裂链转移 杀虫脒 分子印迹技术 固相萃取

杀虫脒（CD）具有高效广谱杀虫和杀螨作用，广泛应用于棉花、水稻、茶树和果蔬等虫害防治［1-2］。CD及其主要代谢产物4-氯邻甲苯胺对脱氧核糖核酸有损伤和诱变作用，对人体具有潜在的致癌性，世界上部分国家将其列为禁用农药。国家质检总局规定蜂蜜中CD及其代谢产物的最大残留限量不超过0.50 mg/kg［3-4］；美国规定动物组织中CD的最大残留限量为0.05～0.25 mg/kg；日本规定动物源食品中CD的最大残留限量为0.01 mg/kg；秘鲁规定牛脂肪、肉及肉制品中CD的最大残留限量为0.50 mg/kg［4］。目前，CD检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等［5-11］，试样前处理存在需要衍生化、操作繁琐、耗时长、稳定性差等问题。

分子印迹技术具有特异识别性，被广泛应用于分子识别、色谱分离、生物免疫等领域［12-13］，但存在聚合不可控性，识别性能受限。可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合法是一种可控自由基聚合法，通过增长自由基向RAFT试剂的可逆链转移而达到调节自由基聚合，从而提高对目标物的特异性吸附。本工作以CD为模板，二苄基三硫代碳酸酯（DBTTC）为试剂，采用RAFT沉淀法制备CD分子印迹聚合物（R-MIP），并将其作为固相萃取柱填料，利用液相色谱法对试样中CD进行分离测定，研究分离效果和回收率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TECNAI G2 F20型透射电子显微镜，美国FEI公司生产；Nicolet-6700型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo公司生产；L2型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司生产；LC-10ATvp型高效液相色谱仪，日本岛津公司生产；ZHWY-200D型多轨道恒温培养振荡器，上海智城分析仪器有限公司生产。

CD，纯度为95%；α-甲基丙烯酸（MAA），纯度为98%；二甲基丙烯酸乙二酯（EDMA），分析纯，纯度为98%；引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），分析纯，纯度为98%；乙腈，色谱纯：均购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。甲醇，CS2，四正丁基溴化铵（TBAB）：均为分析纯，购自天津科密欧公司。

1.2 RAFT试剂的合成

取20 mL质量分数为33%的NaOH溶液和20 mL CS2置于圆底烧瓶中，搅拌混匀，20 min后加入TBAB 0.2 g，搅拌10 min，缓慢加入2 mL氯化苄，于25 ℃反应24 h，将反应产物全部转移到100 mL分液漏斗中，静置分层后，取上层溶液置于比色管中。下层溶液用20 mL CS2反复萃取3次，合并上层溶液，调节pH值为中性后，用无水硫酸钠干燥24 h，减压蒸馏CS2，得到结晶产物即DBTTC［15］。

1.3 印迹聚合物和非印迹聚合物的制备

在50 mL体积比1∶1的甲醇与乙腈混合溶液中加入模板分子CD 0.234 6 g，加入功能单体MAA 100 μL，于室温静置12 h，依次加入交联剂EDMA 10 mL，引发剂AIBN 100 mg，RAFT试剂DBTTC 100 mg，超声使其充分溶解后通入氮气30 min后封口。置于摇床中以300 r/min的速率，于60 ℃振荡24 h，以800 r/min离心分离获得聚合物，用无水乙醇及去离子水分别超声洗涤3次，以体积比为1∶9的乙酸与甲醇混合溶液采用索氏提取法抽提至洗脱液无色，真空干燥，所得产物即为R-MIP，化学反应式见图1。

除不添加模板分子CD外，按上述方法同时制备非印迹聚合物（记作R-NIP）；除不添加DBTTC外，按上述方法同时制备传统印迹聚合物（记作T-MIP）与传统非印迹聚合物（记作T-NIP）。

图1 R-MIP合成原理Fig.1 Principle of R-MIP synthesis

1.4 吸附性能研究

聚合物静态等温吸附：取20 mg R-MIP和R-NIP，向其加入10 mL质量浓度为5～50 µg/mL的CD溶液，静置12 h。测定上层清液中CD的质量浓度，按式（1）计算聚合物的吸附量。

式中：Q为聚合物的吸附量，µg/g；C0为CD的初始质量浓度，µg/mL；Ce为CD的平衡质量浓度，µg/mL；V为吸附溶液的体积，mL；m为聚合物的质量，g。

吸附动力学实验：取20 mg R-MIP和T-MIP，分别加入50 µg/mL的CD溶液10 mL，0.25～2.00 h后检测吸光度，计算R-MIP和T-MIP的吸附量。以吸附量对时间作图，得到R-MIP和T-MIP的吸附动力学曲线。

选择性吸附实验：称取50 mg R-MIP与50 mg R-NIP各6 phr，分别与100 µg/mL的CD溶液混合后静置12 h，研究其选择性吸附性能。

1.5 固相萃取性能评价

固相萃取柱制备：称取100 mg R-MIP，均匀装填入固相萃取空柱管中，通过筛板固定填料，制备印迹聚合物固相萃取柱。萃取条件：以3 mL体积比为9∶1的甲醇与乙酸混合溶液活化或洗脱印迹聚合物固相萃取柱，用5 mL乙腈淋洗。

高效液相色谱（HPLC）检测：称取5 g（精度0.1 mg）市售蜂蜜（如荔枝蜜、杂花蜜及野蜂蜜）置于50 mL离心管中，再加入10 mL乙腈和5 g酸性氧化铝，振荡混匀，超声提取30 min后，以10 000 r/min离心分离10 min，将上层清液移入50 mL容量瓶中。再用5 mL乙腈超声萃取残渣2次，合并上层清液于容量瓶中，用去离子水定容后，取5 mL试样，经印迹聚合物固相萃取柱固相柱处理。检测波长为618 nm，流动相为体积比为55∶45的甲醇与水混合溶液，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 合成产物的红外表征

从图2可以看出：CD标准品3 400 cm-1处为羟基的伸缩振动吸收峰，1 550 cm-1处为C C的骨架振动吸收峰，1 000 cm-1处为磷酸酯P O和C—O的伸缩振动吸收峰。与CD标准品相比，其他3个试样在1 000 cm-1处的波峰明显减弱，这与反应过程中磷酸酯P O键的变化有关，说明CD成功植入分子印迹体系。与洗脱前R-MIP以及空白对照R-NIP对比，洗脱后R-MIP在3 400，1 550 cm-1处的吸收峰变尖锐，且在1 200 cm-1处出现明显的羟基面内弯曲振动吸收峰。这是因为在R-NIP中，羟基主要和C O之间形成氢键，在R-MIP中羟基不仅与C O形成氢键，还与PO形成氢键，R-MIP洗脱之后这部分氢键从缔合态恢复游离态，使羟基吸收峰变得尖锐，表明CD已经被很好的洗脱。

图2 试样的傅里叶变换红外光谱Fig.2 FTIR spectra of chlordimeform，R-NIP（PA）after elution，R-MIP before elution， R-MIP after elution

2.2 聚合物制备条件选择

2.2.1 溶剂对R-MIP形貌的影响

从图3看出：以甲醇或乙腈为溶剂时，制备的R-MIP形态特征呈团聚和絮状；而以体积比为1∶1的甲醇与乙腈混合溶液为溶剂时，制备的R-MIP形态特征为分散状微球，且粒径均匀。这也许是乙腈的较强极性使CD可以较好地在乙腈中溶解，同时极性较强也易影响印迹分子、功能单体与模板分子之间的相互作用力，但以体积比为1∶1的甲醇与乙腈混合溶液为溶剂时，既可促进CD的溶解，又不影响CD与单体之间的相互作用力。

图3 不同溶剂时制备的印迹聚合物的扫描电子显微镜照片Fig.3 SEM images of R-MIP prepared by different solvents

2.2.2 V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）对R-MIP形貌的影响

从表1看出：当V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比为100.0∶1.0∶1.0时，R-MIP呈分散状微球，且粒径均匀；当V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比为100.0∶0.5∶1.0时，R-MIP呈微球状，粒径小且黏连，当引发剂过少时，无法引发催化反应可导致R-MIP呈黏连状微球；当V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比为100.0∶1.0∶0.5时，R-MIP呈微球状，粒径小且黏连，可能是因为DBTTC量较少，不能有效调节微球相分离，使R-MIP呈黏连状。因此，V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）选择100.0∶1.0∶1.0。

表1 不同溶剂时制备R-MIP的合成条件及其形貌特征Tab.1 Synthetic conditions and morphology of polymers prepared in dif f erent solvents

传统方法制备的聚合物粒径小，且粒径分布宽；RAFT法制备的聚合物微球分散，粒径均一，因为DBTTC调节RAFT反应，控制自由基聚合速率，使链转移后，反应体系中自由基数目保持平衡，链增长呈匀速缓慢增长，从而得到均匀微球。

2.3 静态吸附性能

从图4看出：聚合物的吸附量随着CD质量浓度增加而增大，且在考察浓度范围内，印迹聚合物的吸附量始终大于非印迹聚合物。由于印迹聚合物中存在与模板分子相匹配的立体空穴，能够有效吸附模板分子，而R-MIP的吸附量高于T-MIP是由于RAFT法制备的可控性，使印迹聚合物微球分散性好，粒径均匀，因此有较高吸附量。

图4 聚合物的等温吸附曲线Fig.4 Isothermal adsorption curves of polymers

2.4 吸附动力学研究

从图5看出：在开始的200 min内，吸附速率较快；随反应时间的延长，吸附量增加缓慢，并趋于稳定。吸附量在开始快速增加的原因是R-MIP表面存在大量印迹空穴吸附位点，吸附交换的速率较快。随时间的延长，R-MIP表面印迹空穴吸附位点逐渐被CD占用，使吸附速率下降，最终达到饱和。

2.5 选择性吸附研究

图5 R-MIP的吸附动力学曲线Fig.5 Adsorption kinetics curve of R-MIP

为考察印迹聚合物对CD的特异识别性，选择与CD结构相类似的1-（4-氯苯基）哌嗪和2-（3-氯苯基）哌嗪作为竞争吸附底物，用吸附量和印迹因子（α，α=QMIP/QNIP，其中，QMIP与QNIP分别代表MIP和NIP的吸附量）来评价聚合物的特异识别性能，从表2可以看出：MIP对CD的吸附量远大于对1-（4-氯苯基）哌嗪和2-（3-氯苯基）哌嗪的吸附量。这主要是因为MIP中具有与CD相匹配的“记忆空穴”，由此导致MIP对CD具有良好的特异识别性（α=2.91）。NIP对三者的吸附量接近。

表2 选择性吸附数据Tab.2 Selective adsorption data

2.6 分析方法的建立及实际应用

以R-MIP为固相萃取柱填料，利用HPLC对实际试样（荔枝蜜、杂花蜜、野蜂蜜）中CD进行分离测定。从图6可以看出：实际试样中的CD经R-MIP固相萃取萃取净化后，杂质被有效去除，CD出峰时间6.57 min处未见杂质峰干扰，对目标分子CD具有较好的富集净化作用。经HPLC测定，杂花蜜中检测出的CD含量最高，为1.27 µg/kg，其他试样均未检测出CD，这可能是杂花蜜中含有喷洒了 CD农药的花粉，从而导致杂花蜜中有CD残留。

图6 3种蜂蜜试样的分析色谱Fig.6 Chromatogram of three honey samples

为验证所建立方法的精密度和准确度，对荔枝蜜、杂花蜜、野蜂蜜试样进行加标回收率（指在没有被测物质的空白试样中加入定量标准物质，按试样的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值）实验，从表3看出：标准物质质量浓度为0.5～2.0 µg/L时，加标回收率为88.3%～99.2%，相对标准偏差（RSD）小于4.7%（平行实验次数为3次），具有较高的准确度和精密度。以3倍的信噪比计算，CD的测定下限为0.37 µg/kg。说明以R-MIP为固相萃取填料时，可有效分离CD，而且具有回收率高、RSD小，符合方法学指标。

表3 蜂蜜试样中加标回收率Tab.3 Recoveries of samples with standard addition in honey

3 结论

a）采用RAFT技术结合分子印迹沉淀聚合法，以CD为模板分子，DBTTC为试剂，制备了R-MIP，确定了最优制备条件：溶剂为体积比为1∶1的甲醇与乙腈混合溶液，V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）为100.0∶1.0∶1.0。

b）与传统方法制备的印迹聚合物相比，本方法制备的印迹聚合物粒径均一、分散性好、对目标分子有良好的特异识别性，且吸附量高。将其作为固相萃取填料，结合HPLC对蜂蜜中的CD进行分离，富集，检测。加标回收率为88.3%～99.2%，RSD＜4.7%，具有较高的准确度和精密度。

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Preparation and application of chlordimeform molecularly imprinted polymer via RAFT precipitation polymerization

Ma Pengfei， Han Shenghua
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi Datong University， Datong 037009， China）

The chlordimeform（CD）molecularly imprinted polymers（R-MIP）were synthesized via reversible addition-fragmentation chain transfer（RAFT）and molecularly imprinting precipitation polymerization， with CD as template molecule and dibenzyltrithiocarbonate（DBTTC）as solvent. The influences of the solvent and the ratio of monomer/azobisisobutyronitrile/DBTTC on the morphology of the polymer were observed. The adsorption properties of the polymer were studied as well. The results indicate that R-MIP microspheres synthesized under the optimized conditions have uniform particle size， good dispersibility and specific recognition selectivity to target molecules， whose adsorption is higher than that of traditional method.The polymer is used as solid phase extraction material for separation， enrichment， and detection of CD in honey coupled with high performance liquid chromatography. The recoveries of the method ranges from 88.3% to 99.2%， with relative standard deviation less than 4.7%. The lower limit of detection is 0.37 µg/kg.

molecularly imprinted polymer； reversible addition-fragmentation chain transfer；chlordimeform； molecularly imprinting； solid-phase extraction

O 652.6

B

1002-1396（2017）06-0025-05

2017-07-28；

2017-09-15。

马鹏飞，男，1978年生，本科， 2003年毕业于北京化工大学高分子材料和化学工程专业，研究方向为高分子化学。E-mail：dtdxgxl@126.com。

国家自然科学基金（21506120），山西大同大学科学基金项目（2016K5）。