响应面优化海带岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺研究

聂小伟，何粉霞，陈志兵，尹晓斌，孙冬梅，高森森，孙齐卓

（威海海洋职业学院食品工程系，山东威海264300）

响应面优化海带岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺研究

聂小伟，何粉霞，陈志兵，尹晓斌，孙冬梅，高森森，孙齐卓

（威海海洋职业学院食品工程系，山东威海264300）

以海带加工下脚料为试验材料，运用响应面分析，优化超声波辅助酸液提取岩藻聚糖硫酸酯工艺条件。单因素试验显示，在超声波功率为150 W，浸提2次时能达到较好稳定效果。在上述基础上，选取的自变量为浸提液pH值、液料比（mL/g）、浸提温度（℃）和超声波时间（min），响应值为岩藻聚糖硫酸酯提取率（%），结合Box-Behnken试验设计，探讨岩藻聚糖硫酸酯提取率受各因素及其交互作用的影响。结果表明，最佳工艺参数：浸提液为pH1.60、液料比为37∶1（mL/g）、浸提温度为78℃和超声波处理时间为71 min。经试验验证得到，33.86%的岩藻聚糖硫酸酯提取率与34.30%的理论预测值相比，其相对误差为1.28%。由此可见，经优化的工艺参数可靠，回归模型预测效果较好。研究结果可为从海带加工下脚料中岩藻聚糖硫酸酯的提取提供技术参考。

岩藻聚糖硫酸酯；超声波；海带下脚料；响应面分析；提取工艺

我国是海带的主要产地，目前海带主要被应用于提取甘露醇、碘、褐藻酸钠和加工成食品等，其利用的技术水平不高，同时产生大量的废弃物。对其营养成分分析显示，海带干重的70%左右是人体所需的营养元素[1]，其中岩藻聚糖硫酸酯含量极为丰富。但大量的海带加工下脚料因成分复杂，且广泛存在于生产过程中产生的下脚料中，难以处理和利用。通常将其作为废弃物处理，在造成环境污染的同时，还使得大量的生物活性物质的浪费。

海带岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan），是一种成分较为复杂的水溶性大分子多糖，主要是由硫酸基团和L-岩藻糖构成。研究表明：它具有抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗病毒[4-6]和抗肿瘤[7-8]等多种生理活性，并随其在不同领域的应用价值不断推广，对其需求量也在不断增加。因此，如何有效利用海带加工下脚料，提高其岩藻聚糖硫酸酯的提取率，是对其进行高质化利用的关键。

本课题以海带工业生产、加工食品中产生的海带加工下脚料——废弃物为原料，对超声波辅助酸液提取岩藻聚糖硫酸酯工艺参数进行响应面法中Box-Behnke试验设计优化研究，以期能够为海带加工废弃料的综合开发利用提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带加工下脚料：山东海之宝海洋生物科技有限公司提供。将其在60℃下烘干，用高速粉碎机粉碎，测定水分含量，待用。

L-岩藻糖标准物质、盐酸半胱氨酸（生化纯）：国药集团；柠檬酸：吴江市永和精细化工有限公司：95%乙醇：天津中和盛泰化工有限公司；浓硫酸：青岛宝泽化工有限公司；氢氧化钠：北京康普汇维科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-300D数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机：上海科恒实业发展有限公司；RE-3000A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HH型恒温水浴锅：金坛市国旺实验仪器厂；翔艺V1800型可见分光光度计：翔艺仪器（上海）有限公司；CP213型电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；SC-3612低速大容量离心机：中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海带岩藻聚糖硫酸酯浸提工艺流程[9]

海带→洗净（流水冲洗）→烘干（风速6 m/s、温度60℃、3 h、测得水分含量6.8%）→粉粹（高速破碎，过60目筛）→按一定液料比（mL/g）加入一定pH值的柠檬酸溶液→超声波处理（控制超声波功率、温度和时间）→浸提物离心→取上清液→用4 mol/L氢氧化钠溶液中和→低温减压浓缩（真空度小于0.1 MPa，浓缩到原体积的1/3以上）→醇沉（用95%乙醇调节浸提液乙醇浓度至60%）→4℃以下静置（至固液明显分层）→离心取沉淀物（5 000 r/min，10 min）→用95%乙醇洗涤沉淀物，待用→真空干燥（0.1 MPa以下，40℃）→粗品（海带岩藻聚糖硫酸酯）

1.3.2 海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的测定

1.3.2.1 岩藻糖标准曲线的绘制

分别选定L-岩藻糖和纯净水为标准物质和溶剂，配制成浓度为4%的标准物质溶液（4 g/100 mL）。取6只具塞刻度试管，标号为 1、2、3、4、5、6；分别准确移取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的上述标准溶液，加纯净水至1.00 mL；随后，分别加入4.50 mL硫酸溶液（水∶硫酸=6∶1，体积比），振荡摇匀，在冰水浴中冷却1 min；再放置于沸水浴10 min后，用自来水冷却至室温后分别加入3%的半胱氨酸盐酸盐溶液（3 g/100 mL）0.10 mL，摇匀，在 37℃水浴中静置 90 min，分别测定其在396 nm和427 nm下的吸光度，平行测定3次取平均值。以吸光度之差的平均值为纵坐标（Y），标准物质溶液质量浓度为横坐标（X）制作标准曲线，其回归方程式为Y=19.857X+0.008 2，R2=0.998 3。标准物质溶液质量浓度在0.001 mg/mL～0.032 mg/mL范围内，标准曲线相关性较好。

1.3.2.2 海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的计算[10]

将2次浸提液合并，经减压浓缩后，用纯净水定容至200 mL，准确移取1.00 mL上述容量瓶中样品液，按1.2.2.1方法操作，分别在波长为396 nm和427 nm下测定其吸光度，平行测定3次，取吸光度差值的平均值。按标准曲线回归方程和公式1-1计算海带岩藻聚糖硫酸酯的提取率。

式中：n为稀释倍数；C为样品浸提液中岩藻聚糖硫酸酯的质量浓度，mg/mL；V为移取的测定浸提液体积，mL；W为试验原料水分含量，%；m为称取原料的质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

准确称取2.50 g预处理样品，以液料比35 mL/g加入pH2.0的浸提液，在超声波功率120 W，浸提温度60℃和浸提60 min条件下浸提2次，每个水平下重复3次，计算岩藻聚糖硫酸酯的平均提取率。其他条件固定，分别考察浸提液 pH 值（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00）、液料比（10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1、45 ∶1、50 ∶1、55 ∶1、60 ∶1，mL/g）、浸提温度（30、40、50、60、70、80 ℃）、超声波时间（15、25、35、45、55、65、75、85、95、105 min）、超声波功率（120、150、180、210、240、270、300 W） 对藻聚糖硫酸酯提取率的影响。

1.3.4 响应面试验设计

在前期试验和1.2.3的基础上，运用Box-Behnken试验设计，以岩藻聚糖硫酸酯平均提取率作为响应值，对浸提效果影响较大的4个因素，浸提液pH值、液料比、浸提温度和超声波时间及相应水平进行条件优化和响应面分析，因素水平及编码如表1所示。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table 1 Levels and codes of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 数据处理

采用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行方差和响应面分析，以及预测模型的建立，所有试验平行重复3次，响应值取平均值。

2 结果与分析

2.1 浸提次数的确定

图1所示为不同浸提次数的藻聚糖硫酸酯提取率。

图1 浸提次数对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.1 Effect of different temperature on extraction efficiency

从图1中可以看出，当浸提次数超过2次后，提取率变化不明显。所以，确定浸提次数为2次，并对超声波辅助酸液浸提工艺进行优化。

2.2 单因素试验结果[12]

2.2.1 浸提液pH值对海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响

岩藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提液pH值的影响，见图2。

图2 pH值对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.2 Effect of different pH on extraction efficiency

由图2可知，浸提液pH值在1.10～1.50之间，浸提效果随之增加；浸提液pH值为1.50～3.0时，浸提效果随之降低；当浸提液pH值在3.50～5.00之间时，浸提效果趋于平缓，变化不大。由此可见，液料比为40∶1（mL/g），浸提温度70℃，超声波功率为150 W下浸提75 min时，岩藻聚糖硫酸酯的提取率受浸提液pH值的影响较大。pH值过低，酸性较强，可能会导致岩藻聚糖硫酸酯降解，破坏其结构；pH值过大，会导致褐藻胶和褐藻酸沉淀不完全，均会造成岩藻聚糖硫酸酯浸提效果不佳。因此，选定pH 1.50为较佳的浸提液pH值。

2.2.2 液料比对海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响

岩藻聚糖硫酸酯浸提效果受液料比的影响，见图3。

图3 液料比对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.3 Effect of different liquid-solid ratio on extraction efficiency

由图3可知，岩藻聚糖硫酸酯提取率随着液料比的增加而提高。尤其液料比在 10∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）之间时，提取率增加较快；在 35∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）之间时，提取率的变化不明显。这可能是由于浸提液较多，超声波难于作用到样品，使得岩藻聚糖硫酸酯溶出速度减慢，导致提取率的增加缓慢。在实际生产过程中，如果浸提溶剂量太大，后续浓缩困难，导致能耗增加和工作效率降低等问题，因此确定液料比为35∶1（mL/g）较佳。

2.2.3 提温度对海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响

岩藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提温度的影响，见图4。

从图4中可以看出，当温度在30℃～50℃之间时，提取率增加趋于平缓；当温度在50℃～80℃之间时，提取率随温度的升高而显著提高。可能是由于温度越高，分子具有更高动能，运动速度更快，目标物质溶出增加。但过高的温度会增加能耗，造成仪器设备损坏。因此，将浸提温度选定为70℃较合适。

图4 浸提温度对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.4 Effect of different temperature on extraction efficiency

2.2.4 浸提时间对海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响

岩藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提时间的影响，见图5。

图5 浸提时间对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.5 Effect of different time on extraction efficiency

由图5可见，浸提时间在10 min～65 min之间时，提取率随时间延长而升高。但浸提时间超过65 min之后，提取率略有降低，并且随后变化趋于平缓。可能是随加热时间延长，物料获取能量越大，分子运动更剧烈，溶出量越大；但时间过长，能量过高，导致目标物质破坏。同时，避免造成能耗较大等问题，所以选择超声辅助浸提时间65 min较合适。

2.2.5 超声波功率对海带岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响[13]

岩藻聚糖硫酸酯浸提效果受超声波功率的影响，见图6。

由图6可见，超声波功率在120 W～180W之间，提取率随之增加较大；超声波功率在180 W～240W之间，提取率变化不明显。当超声波功率在240 W～300W之间时，提取率随功率的增加显著降低。但在各水平下提取率均达到30%以上，可推断超声波功率对岩藻聚糖硫酸酯提取率影响不显著。同时表明，超声波功率过大，可能会造成岩藻聚糖硫酸酯结构的破坏和分子降解。因此，固定超声波功率为150 W，进行其他因素各水平的浸提优化试验。

图6 浸提功率对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响Fig.6 Effect of different power on extraction efficiency

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面法分析数学模型的建立及显著性分析[14]

在单因素试验的基础上，确定浸提液pH值（X1）、液料比（X2）、浸提温度（X3）、超声波时间（X4）为影响因素，岩藻聚糖硫酸酯提取率为响应值，采用Box-Behnken试验设计原理，实施四因素三水平的响应面分析。运用Design-Expert 8.0试验设计软件，分析处理表2中试验结果数据，得到二次多元回归方程预测模型：

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

续表2 Box-Behnken试验设计及结果Continue table 2 Box-Behnken design with experimental results

对试验结果表2中数据进行方差分析与显著性检验，见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

结果表明，该回归模型高度显著（P＜0.001），失拟项不显著，决定系数R2=0.826 1，R2Adj=0.652 1，说明此回归模型与实际拟合度较好。预测模型方程能很好地拟合真实的响应面，可以很好的用于超声波辅助酸液提取海带加工废弃料中海带岩藻聚糖硫酸酯的提取的工艺条件预测。

同时，可以得出以下结论：通过F检验确定4个因素对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响大小为：X3＞X4＞X2＞X1，即浸提温度（℃）＞超声波时间（min）＞液料比（mL/g）＞浸提液pH值。该回归模型中一次项X3，二次项X12、X32和交互项X2X3、X3X4影响达到高度显著水平（P＜0.01）；二次项 X22、X42和交互相 X1X3影响达到显著水平（P＜0.05）；可见，各因素对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响不是简单的线性关系。

2.3.2 响应面曲面分析[15]

响应面曲面分析见图7。

图7 各两因素交互作用对岩藻聚糖硫酸酯提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot showing the effects of four variables on the extraction rate of fucoidan

响应面图形状，能反映出各因素之间交互作用的强弱程度。当曲面坡度越陡峭、等高线越成椭圆形，表示两因素交互作用影响越强；当曲面坡度越平缓、等高线越成圆形，表示两因素交互作用影响越弱。如图7b、7c、7d所示，响应面坡度较陡峭，且形成椭圆较大，表明浸提温度和浸提液pH值、浸提温度和超声波时间、浸提温度和液料比两两因素之间交互作用较强。如图7a、7e、7f所示，曲面坡度较为平缓，等高线显现圆形，表明液料比和浸提液pH值、超声波时间和浸提液pH值、液料比和超声波时间的两两因素交互效应较弱。同时，由图7b、7c可看出，随着浸提液温度的升高，岩藻聚糖硫酸酯提取率明显提高，也表明浸提温度对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响较大；当浸提温度为70℃～80℃时，提取率达到最高。在试验考察范围内，综合分析图7和表3，可以得出考察因素：浸提温度、超声波时间、液料比和浸提液pH值对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响依次减弱。

2.4 提取工艺条件的验证与确定[16]

为了更明确岩藻聚糖硫酸酯提取的最佳工艺参数，在模型参数范围内采用Design Expert软件进行进一步优化，得到最佳工艺参数为：浸提液pH为1.57、液料比为 36.925∶1（mL/g）、浸提温度为 77.85℃、超声波时间为71.05 min；按上述条件，由预测模型得到岩藻聚糖硫酸酯提取率的最大理论值为34.29%。对响应面法进行可靠性检验，结合实际试验条件，对提取工艺参数进行了适当修正：浸提液pH值为1.60、液料比为37∶1（mL/g）、浸提温度为78℃、超声波时间为 71min。在该修正参数下，得到理论预测值为34.30%，验证试验的平均提取率为33.86%。与理论预测值相比较，计算其相对误差为1.28%。

3 结论

1）以单因素试验为基础，采用Box-Behnken试验设计，构建超声波辅助酸液浸提岩藻聚糖硫酸酯的优化回归模型。在该试验条件范围内，此模型能准确预测岩藻聚糖硫酸酯提取率。

2）通过对Box-Behnken试验设计的试验数据进行方差分析，得到浸提温度（℃）、超声波时间（min）、液料比（mL/g）和浸提液pH值对岩藻聚糖硫酸酯提取率的影响依次减弱。

3）超声波辅助酸液浸提岩藻聚糖硫酸酯优化的较佳工艺参数为浸提液pH值为1.60、液料比为37∶1（mL/g）、浸提温度为78℃、超声波时间为71 min。在该工艺条件下，验证试验的平均提取率为33.86%，与理论预测值相比较，其相对误差为1.28%。结果表明，采用响应面法优化得到的超声波辅助酸液浸提海带加工废弃料中岩藻聚糖硫酸酯浸提工艺参数准确、可信，具有较高的实用价值。

研究结果表明，通过超声波辅助酸液浸提海带加工废弃料中岩藻聚糖硫酸酯，与传统方法对比，不仅大大缩短了浸提时间和降低了加热温度，提高了提取率；而且避免了环境的污染，提高了海带资源的利用率。为海带化工业和食品加工废弃料中岩藻聚糖硫酸酯的进一步开发提供了理论技术依据。

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Study on the Extraction Technology of Fucoidan from Kelp Off-cuts by Response Surface Methodology

NIE Xiao-wei，HE Fen-xia，CHEN Zhi-bing，YIN Xiao-bin，SUN Dong-mei，GAO Sen-sen，SUN Qi-zhuo
（College of Food Engineering，Weihai Ocean Vocational College，Weihai 264300，Shandong，China）

The kelp off-cuts was used as raw materials.The ultrasonic-assisted extraction of fucoidan from kelp off-cuts with acidizing fluid.Fucoidan was optimized using the response surface methodology.The results of onefactor-at-a-time experiments showed that provided the best stability for the proanthocyanidins under power ultrasonics 150 W and extraction two times.pH，liquid to solid ratio（mL/g），extraction temperature（℃），and ultrasonic time（min）were selected as independent variables，while the extraction yield of fucoidan（%）was taken as response variable.The optimization was carried out based on Box-Behnken experimental design by investigating the individual and combined effects of the four factors on the response variable.The optimum extraction conditions were determined as follows：pH was 1.60 water extract with solid-liquid ratio of 37 ∶1（mL/g）at 78℃for 71 min.Under these conditions，the fucoidan yield obtained was 33.86%with a relative error of 1.28%as compared with the model prediction of 34.30%indicating that these parameters are reliable.The experiment result was consistent with the prediction result.This research can provide a technical reference for fucoidan extraction from kelp off-cuts.

fucoidan；ultrasonic；kelp off-cuts；response surface methodology；extraction process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.008

2016年山东省高等学校科技计划项目（J16LE60）；2015年山东省高等学校科技计划项目（J15LE55）

聂小伟（1984—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：海洋食品综合资源开发利用。

2017-04-11