泉州湾3种大型海藻不同提取物的抗氧化活性比较

陈琳琳，谢志新，魏东红，彭飞，张文州，许嵘

（泉州医学高等专科学校，福建泉州362000）

泉州湾3种大型海藻不同提取物的抗氧化活性比较

陈琳琳，谢志新，魏东红，彭飞，张文州，许嵘

（泉州医学高等专科学校，福建泉州362000）

比较泉州湾3种大型海藻不同提取物的抗氧化活性及其与总酚、总黄酮和总糖含量之间的关系，选取出抗氧化活性高的提取物和海藻。采用羟自由基清除试验、超氧阴离子自由基清除试验及DPPH自由基清除试验考察3种海藻不同提取物的抗氧化活性。结果表明，3种大型海藻的不同提取物均具有较高的抗氧化活性，且在一定浓度范围内，其清除自由基的能力与浓度成正相关，并与总酚、总黄酮及总糖含量具有相关性。浓度为1 mg/mL时，鼠尾藻水提物的清除羟自由基能力最强，为46 819.97 U/mL；长松藻乙醇提取物的抗超氧阴离子活力最强，为18 571.43 U/L；铁钉菜甲醇提取物的清除DPPH自由基能力最高，为39.28%。同时筛选出铁钉菜及鼠尾藻的3种不同提取物作为天然抗氧化剂进行相关产品的开发。

海藻；提取物；抗氧化活性

人体正常生理活动或氧化压力过剩，体内会不断产生活性氧自由基，当今社会人们的生活节奏飞快，工作压力巨大，加之生活环境污染的加剧都使得人体更容易产生自由基。许多研究证实过剩的自由基会导致细胞衰老，产生各种衰老性疾病[1-5]。自由基清除剂和抗氧化剂是保护细胞免受或减缓自由基引发的氧化损伤的一个有效途径[6-8]，能预防及保护受氧化损伤的细胞。但自20世纪70年代以来，陆续发现人工合成的自由基清除剂或抗氧化剂多有不良反应[8-9]，因此天然来源抗氧化剂的开发越来越受到关注，从天然动植物资源中筛选出高效、安全的自由基清除剂或抗氧化剂，并使它们替代化学合成的自由基清除剂或抗氧化剂应用于食品、药品、化妆品等领域，促使清除过剩自由基的方式从医疗治疗型模式向医疗保健型模式转变。

作为海洋中有机物的原始生产者，已有大量研究表明海藻具有多种功能特性，包括抗肿瘤[10-15]、抗病毒[16-18]、抗菌[19-21]、抗氧化[12，17，22-24]、抗炎[25]、保湿[26-27]等。海藻中的生物活性物质在人类健康及环境问题上具有巨大的潜力和优势。本文选取泉州围头湾海域的三种大型海藻，用不同提取方法制备成不同提取物进行羟自由基、超氧阴离子及DPPH自由基清除能力的比较，从海藻中筛选出高效、安全的自由基清除剂，为其在食品、药品及化妆品等领域的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

长松藻Codium cylindricum Holmes，铁钉菜Ishige.okamurai Yendo，鼠尾藻 Sargassum thunbergii（Mert.）O.Kuntze。三种海藻均釆自福建泉州围头湾潮间带，由泉州师范学院黄晓冬副教授鉴定，采集后，洗净、去杂、沥干后冷冻保存。

羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基苦基苯肼DPPH（BR）：西亚试剂公司；没食子酸对照品、芦丁对照品：北京普天同创生物科技有限公司；甲醇（AR）、无水乙醇（AR）、苯酚（AR）、无水葡萄糖（AR）：西陇化工有限公司；Folin-Ciocalteu试剂（AR）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 设备

DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪EYELA N-1100：上海爱明仪器有效公司；LGJ-18B冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FA1604型电子天平：上海天平仪器厂；752型分光光度计：上海光谱仪器厂；高速组织捣碎机：无锡沃信仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海藻提取物制备

将采集处理后的海藻冷冻干燥后，置组织捣碎机粉碎，粉末用甲醇浸泡提取至无色，合并甲醇提取液并减压蒸馏浓缩，得到甲醇提取物。剩余残渣用蒸馏水提取3次，合并提取液，加入60%乙醇，离心，得沉淀部分为乙醇提取物，上清液为水提物，均作为测试样品。

1.3.2 海藻提取物中总酚、总黄酮及总糖的含量测定

采用福林酚法[28]测定总酚含量，总酚含量以没食子酸计（y=0.108x-0.097，R2=0.999，线性范围为 1.0 μg～6.0 μg）；参照黄晓冬等[29]的方法测定总黄酮含量，总黄酮含量以芦丁计（y=0.004x+0.004，R2=0.999，线性范围为 0～20.0 μg）；采用硫酸-苯酚法测定总糖含量，总糖含量以无水葡萄糖计（y=0.022 8x+0.034 7，R2=0.994，线性范围为 0～40.0 μg）。

1.3.3 清除羟自由基能力测定

参照陈琳琳等[30]的方法，采用南京建成生物工程研究所的羟自由基测定试剂盒进行测定，每个浓度组平行测定3次，求其平均值。

式中：A对照为底物应用液的吸光度；A标准为0.03%H2O2标准应用液的吸光度；A样品为样品实验组的吸光度；A空白为蒸馏水的吸光度；标准样品浓度为8.824 mmol/L，N为样本测试前稀释倍数。

1.3.4 清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力测定

参照陈琳琳等[30]的方法，采用南京建成生物工程研究所的抗超氧阴离子自由基测定试剂盒进行测定，每个浓度组平行测定3次，求其平均值。

式中：A对照为蒸馏水及试剂应用液的吸光度；A标准为0.15 mg/mL维生素C标准品的吸光度；A样品为样品实验组的吸光度；标准样品浓度为0.15 mg/mL；N为样本测试前稀释倍数。

1.3.5 清除DPPH自由基能力测定

参照黄晓冬等[31]的方法进行测定。每个浓度组平行测定3次，求其平均值。DPPH·清除率S/%=[1-（As-Ab）/Ac]×100。式中：As为样品实验组的吸光度；Ac为空白对照的吸光度；Ab为样品本底的吸光度。

1.4 数据统计分析

实验数据采用Microsoft Excel 2007与IBM SPSS Statistics 24.0等软件进行数据处理与统计分析；实验数据以平均值±标准差（±SD）表示；采用单因素方差分析比较组间差异，再利用最小显著差数法（Least Significant Difference，LSD）进行两两比较；选用皮尔森（Pearson）相关系数分析相关性。

2 结果与分析

2.1 3种海藻不同提取方法提取物的总酚、总黄酮及总糖含量

3种海藻不同提取物的总酚、总黄酮及总糖含量见表1。

表1 3种海藻不同提取物的总酚、总黄酮及总糖含量（±SD，n=3）Table 1 The contents of total phenolic，total flavonoids and total sugar in different extracts from three seaweeds

表1 3种海藻不同提取物的总酚、总黄酮及总糖含量（±SD，n=3）Table 1 The contents of total phenolic，total flavonoids and total sugar in different extracts from three seaweeds

注：a表示甲醇提取物所含物质含量与乙醇提取物所含物质含量相比差异具有统计学意义；b表示甲醇提取物所含物质含量与水提物所含物质含量相比差异具有统计学意义；c表示乙醇提取物所含物质含量与水提物所含物质含量相比差异具有统计学意义。

海藻种类项目含量/（μg/mg）FP甲醇提取物 乙醇提取物 水提物长松藻 总酚含量 25.56±0.19ab 22.10±0.11c 20.80±0.11 205 385.996 <0.05总黄酮含量 19.26±0.16ab 3.89±0.28c 2.41±0.16 26 087.862 <0.05总糖含量 323.23±0.67ab 89.90±0.44c 15.00±0.08 592 326.635 <0.05铁钉菜 总酚含量 111.73±0.11ab 54.75±0.11c 110.86±0.28 93 244.793 <0.05总黄酮含量 163.43±1.43ab 57.96±0.89c 26.57±0.16 16 201.486 <0.05总糖含量 11.91±0.00ab 181.64±0.00c 68.63±0.13 4 191 988.212 <0.05鼠尾藻 总酚含量 42.35±0.21ab 51.85±0.19c 31.42±0.11 10 287.875 <0.05总黄酮含量 43.33±0.00ab 63.43±0.16c 9.91±0.16 127 873.499 <0.05总糖含量 29.38±0.13ab 51.82±0.22c 5.77±0.00 74 434.750 <0.05

由表1可知，总酚含量和总黄酮含量最高的是铁钉菜，总糖含量最高的是长松藻。从提取方法来看，甲醇提取物中，总酚含量和总黄酮含量最高的为铁钉菜，总糖含量最高的为长松藻；乙醇提取物中，总酚含量最高的为铁钉菜，总黄酮含量最高的为鼠尾藻，总糖含量最高的为铁钉菜；水提物中，总酚含量、总黄酮含量及总糖含量最高的均为铁钉菜。铁钉菜各提取物的总酚、总黄酮及总糖含量均较高；长松藻各提取物总糖含量次之，但总酚及总糖含量均较低；铁钉菜各提取物总酚及总黄酮含量次之，但总糖含量较低。LSD多重比较显示同一种海藻的各提取物之间的总酚、总黄酮及总糖含量的差异比较均具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 3种海藻不同提取物清除羟自由基能力比较

浓度为1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的羟自由基清除率如表2所示，LSD多重比较显示同一种海藻的各提取物之间的羟自由基清除率的差异比较均具有统计学意义（P<0.05）。

表2 1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的清除羟自由基能力Table 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of different extracts from three seaweeds in 1.0 mg/mL

不同浓度的3种海藻不同提取物清除羟自由基能力如图1、图2及图3所示。

长松藻、铁钉菜及鼠尾藻3种海藻的3种不同提取物对羟自由基的清除能力均随着浓度的增加而增大。其中长松藻的甲醇提取物和水提物的羟自由基清除能力相近，其乙醇提取物的羟自由基清除能力较其他两种提取物低。铁钉菜的水提物在其3种提取物中的清除羟自由基能力最强，且铁钉菜水提物在较低浓度下就呈现很强的清除羟自由基能力，其清除羟自由基能力随浓度增大而增加的幅度并不明显，而铁钉菜甲醇提取物和乙醇提取物的羟自由基清除能力相近。鼠尾藻的水提物在其3种提取物中的清除羟自由基能力最强，且鼠尾藻水提物同样在较低浓度下就呈现很强的清除羟自由基能力，其清除羟自由基能力随浓度增大而增加的幅度并不明显，鼠尾藻甲醇提取物的清除羟自由基能力次之，乙醇提取物的最低。3种不同提取物中，清除羟自由基能力的顺序均为鼠尾藻＞铁钉菜＞长松藻，且鼠尾藻与铁钉菜的清除羟自由基能力相差不大，长松藻的清除能力最低。

图1 不同浓度的3种海藻甲醇提取物羟自由基清除率比较Fig.1 Hydroxyl radical scavenging rate of methanol extracts from three seaweeds in different concentration

图2 不同浓度的3种海藻乙醇提取物羟自由基清除率比较Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of ethanol extracts from three seaweeds in different concentration

图3 不同浓度的3种海藻水提物羟自由基清除率比较Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rate of water extracts from three seaweeds in different concentration

1.0 mg/mL 3种海藻不同提取物抑制羟自由基能力比较见图4、表3。

由图4可知，在样品浓度均为1.0 mg/mL时，抑制羟自由基能力的顺序为鼠尾藻水提物＞铁钉菜水提物＞鼠尾藻甲醇提取物＞鼠尾藻乙醇提取物＞铁钉菜甲醇提取物＞长松藻乙醇提取物＞铁钉菜乙醇提取物＞长松藻水提物＞长松藻甲醇提取物，鼠尾藻水提物的抑制羟自由基能力最强，为46 819.97 U/mL。

图4 1.0 mg/mL 3种海藻不同提取物抑制羟自由基能力比较Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity of different extracts from three seaweeds in 1.0 mg/mL

表3 1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的清除羟自由基能力与总酚、总黄酮及总糖含量之间的关系Table 3 The relationship between hydroxyl radical scavenging capacity of different extracts and total phenolic，total flavonoids，total sugar in 1.0 mg/mL

由表3的相关性分析可知不同海藻不同提取物对羟自由基清除能力起主要作用的主要成分。长松藻清除羟自由基能力与总黄酮含量之间具有显著正相关（P<0.05），说明总黄酮是长松藻清除羟自由基的主要成分；铁钉菜甲醇提取物清除羟自由基能力与总酚及总糖含量之间具有极显著正相关（P<0.01），乙醇提取物清除羟自由基能力与总酚含量之间具有极显著正相关（P<0.01）；鼠尾藻甲醇提取物及乙醇提取物清除羟自由基能力与总糖含量之间具有极显著正相关（P<0.01）。

2.3 3种海藻不同提取物清除超氧阴离子能力比较

浓度为1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的超氧阴离子清除率如表4所示，LSD多重比较显示同一种海藻的各提取物之间的超氧阴离子清除率的差异比较均具有统计学意义（P<0.05）。

表4 1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的清除超氧阴离子能力Table 4 Superoxide anion scavenging capacity of different extracts from three seaweeds in 1.0 mg/mL

不同浓度的3种海藻不同提取物清除超氧阴离子能力如图5、图6及图7所示。

图5 不同浓度的3种海藻甲醇提取物超氧阴离子清除率比较Fig.5 Superoxide anion scavenging rate of methanol extracts from three seaweeds in different concentration

图6 不同浓度的3种海藻乙醇提取物超氧阴离子清除率比较Fig.6 Superoxide anion scavenging rate of ethanol extracts fromthree seaweeds in different concentration

长松藻、铁钉菜及鼠尾藻3种海藻的3种不同提取物对超氧阴离子的清除能力均随着浓度的增加而增大。长松藻中，其乙醇提取物清除超氧阴离子能力最强。铁钉菜中，其水提物清除超氧阴离子能力最强，甲醇提取物与乙醇提取物的清除能力相近。鼠尾藻中，甲醇提取物清除超氧阴离子能力最强。在样品浓度均为15 mg/mL时，3种海藻不同提取物对超氧阴离子的清除率均未超过50%。用甲醇处理的提取物中，鼠尾藻的清除能力最强，而长松藻和铁钉菜的清除能力相近。乙醇处理的提取物中，清除超氧阴离子能力的顺序为长松藻＞鼠尾藻＞铁钉菜。对于水提物，清除超氧阴离子能力的顺序为铁钉菜＞长松藻＞鼠尾藻。

图7 不同浓度的3种海藻水提物超氧阴离子清除率比较Fig.7 Superoxide anion scavenging rate of water extracts from three seaweeds in different concentration

1.0 mg/mL 3种海藻不同提取物的抗超氧阴离子活力比较见图8、表5。

图8 1.0 mg/mL 3种海藻不同提取物的抗超氧阴离子活力比较Fig.8 Superoxide anion scavenging capacity of different extracts from three seaweeds in 1.0 mg/mL

表5 1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的清除超氧阴离子自由基能力与总酚、总黄酮及总糖含量之间的关系Table 5 The relationship between superoxide anion scavenging capacity of different extracts and total phenolic，total flavonoids，total sugar in 1.0 mg/mL

由图8可知，在样品浓度均为1.0 mg/mL时，抗超氧阴离子活力的顺序为长松藻乙醇提取物＞鼠尾藻提甲醇取物＞长松藻甲醇提取物＞铁钉菜水提物=鼠尾藻乙醇提取物＞铁钉菜乙醇提取物＞鼠尾藻水提物＞铁钉菜甲醇提取物＞长松藻水提物，长松藻乙醇提取物的抗超氧阴离子活力最强，为18 571.43 U/L。

由表5的相关性分析可知不同海藻不同提取物对超氧阴离子清除能力起主要作用的主要成分。长松藻甲醇提取物及水提物清除超氧阴离子能力与总酚含量之间具有极显著正相关（P<0.01）和显著正相关（P<0.05），长松藻乙醇提取物清除超氧阴离子能力与总黄酮含量之间具有显著正相关（P<0.05）；铁钉菜乙醇提取物及水提物清除超氧阴离子能力与总糖含量之间具有极显著正相关（P<0.01）；鼠尾藻乙醇提取物清除超氧阴离子能力与总酚及总糖含量之间具有显著正相关（P<0.05）和极显著正相关（P<0.01），鼠尾藻水提物清除超氧阴离子能力与总黄酮含量之间具有极显著正相关（P<0.01）。

2.4 3种海藻不同提取物清除DPPH自由基能力比较

浓度为1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的DPPH自由基清除率如表6所示。

表6 1.0 mg/mL的三种海藻不同提取物的清除DPPH自由基能力Table 6 DPPH free radical scavenging capacity of different extracts from three seaweeds in 1.0 mg/mL

LSD多重比较显示同一种海藻的各提取物之间的DPPH自由基清除率的差异比较均具有统计学意义（P<0.05）。在样品浓度均为1.0 mg/mL时，清除DPPH自由基能力的顺序为铁钉菜甲醇提取物＞长松藻乙醇提取物＞长松藻甲醇提取物＞铁钉菜水提物＞铁钉菜乙醇提取物＞鼠尾藻乙醇提取物＞鼠尾藻水提物＞鼠尾藻甲醇提取物＞长松藻水提物。

不同浓度的3种海藻不同提取物清除DPPH自由基能力如图9、图10及图11、表7所示。

图9 不同浓度的3种海藻甲醇提取物的DPPH自由基清除率比较Fig.9 DPPH free radical scavenging rate of methanol extracts from three seaweeds in different concentration

图10 不同浓度的3种海藻乙醇提取物的DPPH自由基清除率比较Fig.10 DPPH free radical scavenging rate of ethanol extracts from three seaweeds in different concentration

图11 不同浓度的3种海藻水提物的DPPH自由基清除率比较Fig.11 DPPH free radical scavenging rate of water extracts from three seaweeds in different concentration

长松藻、铁钉菜及鼠尾藻3种海藻的3种不同提取物对DPPH自由基的清除能力均随着浓度的增加而增大。长松藻中，其乙醇提取物清除DPPH自由基能力最强，甲醇提取物清除能力次之，水提物的清除能力最小。铁钉菜中，其甲醇提取物清除DPPH自由基能力最强，乙醇提取物次之，水提物的清除能力最小。鼠尾藻中，甲醇提取物与乙醇提取物清除DPPH自由基能力相近，水提物清除能力最低。

续表7 1.0 mg/mL的3种海藻不同提取物的清除DPPH自由基能力与总酚、总黄酮及总糖含量之间的关系Continue table 7 The relationship between DPPH free radical scavenging capacity of different extracts and total phenolic，total flavonoids，total sugar in 1.0 mg/mL

甲醇提取物中，清除DPPH自由基能力的顺序为铁钉菜＞鼠尾藻＞鼠尾藻，且鼠尾藻甲醇提取物在15 mg/mL浓度下清除率未超过50%。乙醇提取物中，长松藻清除DPPH自由基的能力最强，铁钉菜和鼠尾藻的清除能力相近。水提物中，铁钉菜和鼠尾藻清除DPPH自由基能力相近，长松藻清除能力最低，且3种海藻的水提物在15 mg/mL浓度下清除率均未超过50%。

由表7的相关性分析可知不同海藻不同提取物对DPPH自由基清除能力起主要作用的主要成分。长松藻甲醇提取物清除DPPH自由基能力与总黄酮含量之间具有极显著正相关（P<0.01），长松藻乙醇提取物清除DPPH自由基能力与总黄酮含量及总糖含量之间具有极显著正相关（P<0.01）和显著正相关（P<0.05），长松藻水提物清除DPPH自由基能力与总糖含量之间具有显著正相关（P<0.05）；铁钉菜甲醇提取物及乙醇提取物清除DPPH自由基能力与总酚及总黄酮含量之间具有显著正相关（P<0.05）和极显著正相关（P<0.01），且铁钉菜乙醇提取物清除DPPH自由基能力还与总糖含量之间具有显著正相关（P<0.05），铁钉菜水提物清除DPPH自由基能力与总黄酮含量之间具有极显著正相关（P<0.01）；鼠尾藻甲醇提取物清除DPPH自由基能力与总酚及总黄酮含量之间具有极显著正相关（P<0.01），鼠尾藻乙醇提取物清除DPPH自由基能力与总糖含量之间具有显著正相关（P<0.05），而鼠尾藻水提物清除DPPH自由基能力与总糖含量之间具有极显著正相关（P<0.01）。

3 结论与讨论

研究表明总酚含量和总黄酮含量最高的是铁钉菜，总糖含量最高的是长松藻。3种大型海藻的不同提取物均具有较高的抗氧化活性，且在一定浓度范围内，其清除自由基的能力与浓度成正相关，并与总酚、总黄酮及总糖含量具有相关性。其中，鼠尾藻水提物的清除羟自由基能力最强，铁钉菜3种提取物的清除羟自由基能力均较高；长松藻乙醇提取物的抗超氧阴离子活力最强；铁钉菜3种提取物的清除DPPH自由基能力均较高。样品浓度为1 mg/mL时，鼠尾藻水提物的清除羟自由基能力最强，为46 819.97 U/mL；长松藻乙醇提取物的抗超氧阴离子活力最强，为18571.43U/L；铁钉菜甲醇提取物的清除DPPH自由基能力最高，为39.28%。

由于抗氧化机制多途径、多环节、多靶点的特点，一类抗氧化成分或一种单体的抗氧化活性并不见得强于多种抗氧化成分的混合体（有效部位群），各种成分的交互作用才是其抗氧化作用的重要因素[32]。因此在探明抗氧化物质的基础上，开发铁钉菜、鼠尾藻不同提取物的抗氧化产品，同时拟借鉴中药配伍组合的理念，将铁钉菜及鼠尾藻3种提取部位进行配伍组合，研发相关的抗氧化功能产品具有一定的可行性。

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Antioxidant Activity of the Different Extracts from Three Seaweeds in Fujian Quanzhou Bay

CHEN Lin-lin，XIE Zhi-xin，WEI Dong-hong，PENG Fei，ZHANG Wen-zhou，XU Rong
（Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，Fujian，China）

Comparison of antioxidant activities of the different extracts from three seaweeds in Fujian Quanzhou Bay.Research for the relationship between antioxidant activity of the extracts and total phenolics，total flavonoids and total sugar.Selecting the extracts and seaweeds with high antioxidant activity.The antioxidant activities of the extracts were determined with hydroxyl radical scavenging test、superoxide anion radical scavenging test and DPPH（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl）free radical scavenging test.The results show that the different extracts from three seaweeds with high antioxidant activities had positively correlated between the ability of scavenging free radical and concentration within a range of certain concentration.And the antioxidant activities were correlated with the contents of total phenolic，total flavonoids and total sugar.At 1.0 mg/mL，the hydroxyl radical scavenging capacity of Sargassum thunbergii（Mert.）O.Kuntze extract from water was best，which was 46 819.97 U/mL；the superoxide anion activity of Codium cylindricum Holmes extract from ethanol precipitate was best，which was 18 571.43 U/L；and the DPPH free radical scavenging capacity of Ishige.okamurai Yendo extract from methanol was the highest，which was 39.28%.Selection of natural antioxidants from the different extracts of Ishige.okamurai Yendo and Sargassum thunbergii（Mert.）O.Kuntze，and developing products with the extracts.

seaweed；extract；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.004

福建省中青年教师教育科研项目（JA15721、JA15715）；泉州市指导性科技计划项目（2015ZD36、2015ZD35）；福建省自然科学基金项目（2016J01175）

陈琳琳（1984—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物分离分析与应用。

2017-05-31