鲍曼不动杆菌对8种常用抗菌药物敏感试验不同方法的比较

温海楠， 谢守军， 赵建宏， 孙 倩， 魏宏莲， 时东彦， 李志荣， 徐 丽， 闻海峰

鲍曼不动杆菌对8种常用抗菌药物敏感试验不同方法的比较

温海楠1， 谢守军1， 赵建宏2，3， 孙 倩2， 魏宏莲2， 时东彦2， 李志荣3， 徐 丽4， 闻海峰5

目的分析河北省细菌耐药性监测网（Hebarin）鲍曼不动杆菌耐药性监测数据，验证不同药敏试验方法结果，提高耐药性监测数据质量，指导临床实验室使用合理的药敏试验方法。方法回顾性分析Hebarin鲍曼不动杆菌药敏数据。收集126株鲍曼不动杆菌，应用E试验法、纸片扩散法和VITEK仪器法检测其对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南的药敏试验结果。结果126株鲍曼不动杆菌药敏试验结果显示，3种方法中细菌对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢他啶药敏结果存在明显差异（P＜0.05）；纸片扩散法的分类一致性、一般错误率、严重错误率、极严重错误率均在可接受范围，纸片扩散法和VITEK仪器法对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星的分类一致性存在明显差异（P＜0.05）。结论不同的药敏试验方法会导致不同的耐药结果，从而使耐药监测数据出现方法学的差异。应用VITEK仪器进行药敏试验时，哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星的药敏结果要结合纸片扩散法或E试验方法进行验证，以便更加准确地指导临床用药。

鲍曼不动杆菌； E试验法； 纸片扩散法； VITEK

鲍曼不动杆菌是医院环境中常见的条件致病菌，该菌具有多重耐药性和易于传播性，可以通过院内的各种媒介传给患者，导致感染。随着近年来广谱抗生素的大量使用，鲍曼不动杆菌可以引起很多科室的感染流行[1-2]。鲍曼不动杆菌可通过多种途径规避抗菌药物的作用，能够主动获取外源性耐药基因，发展成为多重耐药菌株，并对多种类型的抗菌药物耐药，如碳青霉烯类、四环素类、头孢菌素类、喹诺酮类等[3]。鲍曼不动杆菌在不同地区的耐药率存在一定的差异，2015年全国细菌耐药性监测网显示鲍曼不动杆菌上报数据排名革兰阴性菌的第4位，对碳青霉烯类耐药率为25.6%～82.1%，全国平均耐药率为59.0%，其中河北省耐药率为65.1%[4]。亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对多种抗生素的耐药率都在50%以上，部分甚至达100%[5]。目前鲍曼不动杆菌的临床实验室药敏试验方法主要有纸片扩散法、E试验法、仪器法等。在统计2016年河北省细菌耐药性监测网（Hebarin）数据结果时发现，鲍曼不动杆菌因各临床实验室使用药敏方法的不同而使耐药性呈现较大差别，而准确规范的药敏方法是保证临床正确用药、实现有效治疗的前提。鲍曼不动杆菌耐药日趋严重，对临床药敏试验结果的准确性也提出了较高的要求。因此本课题选取临床分离鲍曼不动杆菌菌株使用不同的药敏试验方法对结果进行验证。

本研究应用E试验法为参考方法，对临床实验室常用的纸片扩散法和VITEK仪器法对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南8种抗菌药物进行药敏试验，比较不同药敏试验方法的分类一致性及抗菌药物的敏感性，探讨Hebarin鲍曼不动杆菌药敏试验结果的质量，并指导实验室应用适当或补充的药敏试验方法对鲍曼不动杆菌进行药敏试验，保证药敏试验结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1数据来源 Hebarin共收集42所医院上报的耐药数据，剔除菌株总量不足的5所医院后，剩余37所医院的数据纳入分析。纳入分析的37所医院通过“全国细菌耐药性监测网”将数据上报后，Hebarin使用WHONET5.6软件对数据进行筛选、分析、统计。

1.1.2菌株来源 收集2016年11月承德医学院附属医院、河北医科大学第二医院临床住院患者分离到的126株鲍曼不动杆菌（实验组），剔除同一患者的同一标本来源的重复分离株。所有菌株需经VITEK 2-Compact GN卡进行鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853，购自卫生部临检中心。

1.1.3试剂与仪器 水解酪蛋白琼脂（MH）购自温州康泰公司；药敏纸片包括哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南均为英国OXOID产品；哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南E试验条为温州康泰公司产品；VITEK 2-Compact GN-AST09药敏卡为法国生物梅里埃公司产品。

1.2 方法

1.2.1药敏试验方法及结果判读 药敏试验方法、质量控制及结果判读：敏感（S）、中介（I）、耐药（R）遵循美国CLSI M100S（2016年版）进行操作[6]；VITEK 2-Compact系统试验方法、质量控制遵循仪器药敏试验操作说明。本研究应用E试验法为参考方法。

1.2.2数据标准 根据CLSI M23-A2文件[7]，分类一致性（categorical agreement，CA）指实验方法与参考方法的符合率，极严重错误率（very major errors，VME）指参考方法的结果为 R，实验方法为 S； 严重错误率（major errors，ME）指参考方法的结果为S，实验方法为 R；一般错误率（minor errors，MIE）指参考方法的结果为R或S，实验方法为I，或者参考方法的结果是I，实验方法为S或R；可接受的误差范围为：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，MIE≤10%。

1.2.3统计学方法 用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用卡方检验对各种方法的S%、I%、R%进行比较，并对各检测方法与E试验法之间的一致性进行检验。

2 结果

2.1 Hebarin数据分析

使用WHONET5.6软件对Hebarin中的鲍曼不动杆菌药敏试验结果回顾性分析。发现对鲍曼不动杆菌应用VITEK仪器法、纸片扩散法检测的药敏结果存在差异。如对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南的2种药敏方法的耐药结果均不一致。

2.2 E试验法、纸片扩散法和VITEK仪器法药敏试验结果比较

对收集的126株鲍曼不动杆菌应用E试验法、纸片扩散法和VITEK仪器法针对上述抗菌药物进行药敏试验，环丙沙星、亚胺培南、美罗培南的3种方法的药敏试验结果无差别；哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢他啶药敏试验结果存在明显差异（P＜0.05），结果见表1。

表1 126株鲍曼不动杆菌纸片扩散法、VITEK仪器法和E试验法药敏试验结果比较 Table 1 The antimicrobial susceptibility results of 126 Acinetobacter baumannii strains tested by Kirby-Bauer method，VITEK and E-test method

2.3 Hebarin与本研究结果比较

Hebarin鲍曼不动杆菌耐药率与本研究实验组中126株鲍曼不动杆菌耐药率结果比较，纸片扩散法，Hebarin对8种药物的耐药率均高于实验组；VITEK仪器法，Hebarin仅对阿米卡星的耐药率高于本实验组，MIC50、MIC90均为4 mg/L；实验组E试验法MIC50结果均高于其他方法。见图1、表2。

2.4 纸片扩散法和VITEK仪器法与E试验法比较

以E试验法为参考方法，纸片扩散法和VITEK仪器法CA、MIE、ME、VME分析结果，见表3。其中，纸片扩散法几种抗菌药物的CA均大于90%，MIE为0～6.3%，ME为0，VME为0，均在可接受范围。VITEK仪器法哌拉西林-他唑巴坦：CA为86.5%，MIE为13.5%；阿米卡星：CA为50.0%，VME为46.8%；左氧氟沙星：VME为1.6%，按照判断标准均为不可接受的结果。哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星的CA比较存在明显差异（P＜0.05）。

图1 Hebarin和实验组鲍曼不动杆菌耐药率Figure 1 The resistance rates of Acinetobacter baumannii

表2 鲍曼不动杆菌MIC50和MIC90结果Table 2 The MIC50 and MIC9 values of eight antimicrobial agents against Acinetobacter baumannii strains（mg/L）

表3 纸片扩散法和VITEK仪器法与E试验法结果比较Table 3 The susceptibility results of Kirby-Bauer method and VITEK compared with E-test（%）

3 讨论

鲍曼不动杆菌是医院感染的重要致病菌之一，其对常用抗菌药物的耐药率呈逐年上升的趋势。该菌具有多重耐药和交叉耐药的特性，对抗感染治疗提出了巨大的挑战[8-9]。准确的药敏试验结果对临床合理使用抗菌药物具有重要的指导意义。国家也为抗生素的合理使用制定了一系列计划，包括选取符合条件的医院参加全国细菌耐药性监测网，及时准确上报数据，以及抗生素合理使用专项计划等活动。Hebarin每年组织专家对本省多所医院上报的数据进行分析，参加Hebarin的成员单位均具有良好的实验基础，室内质控合格，且已通过国家或本省室间质评。但通过对上报的数据分析来看，不同医院由于药敏试验方法、仪器质量、操作手法等原因可使结果呈现较大差异。分析Hebarin中的鲍曼不动杆菌纸片扩散法和VITEK仪器法的药敏试验结果，发现鲍曼不动杆菌对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南的耐药率明显不同，本课题选取临床菌株使用不同的药敏试验方法对上述的试验结果进行验证。

我们通过实验验证显示，126株鲍曼不动杆菌应用E试验法、纸片扩散法和VITEK仪器法进行药敏试验，对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢他啶药敏结果存在明显差异，与Hebarin鲍曼不动杆菌药敏方法数据趋势一致；而环丙沙星、亚胺培南、美罗培南的3种方法结果之间无差别，与Hebarin的结果不一致。对比Hebarin鲍曼不动杆菌对上述抗菌药物VITEK仪器法的MIC50和MIC90结果，本实验的MIC50与Hebarin MIC50一致，MIC90大致低于Hebarin 1个稀释度，由此可推断药敏试验结果可能与Hebarin药敏数据不完全一致，但是药敏试验方法确实存在差异，可能与选取的样本或药敏试验方法有关。VITEK仪器法MIC50、MIC90均低于E试验方法，这可能导致整体耐药率偏低，是导致Hebarin VITEK仪器法的耐药率普遍低于纸片法的原因。为了进一步探究结果不一致的原因，我们以E试验法为参考方法，应用纸片扩散法和VITEK仪器法进行了药敏试验的比较。结果发现，纸片扩散法药敏结果与参考方法更吻合，实验中的8种抗菌药物CA、MIE、ME、VME均在可接受范围，而VITEK仪器法哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星均有不可接受的结果出现。闻海丰等[10]通过对Hebarin的数据分析及对538株鲍曼不动杆菌的药敏试验方法分析发现，VITEK仪器法检测阿米卡星敏感性试验结果与标准方法差异较大，与本研究结果一致。VITEK仪器法检测阿米卡星的敏感率远高于其他方法，与阿米卡星对鲍曼不动杆菌的抗菌作用中介于细菌明显生长与完全不生长之间存在的缓慢生长区有关[11]，VITEK仪器法检测时间多在8 h内，此时正处于细菌的缓慢生长区，从而导致仪器的假敏感现象，而非正常的稀释法结果。但哌拉西林-他唑巴坦和左氧氟沙星这2种药物在VITEK仪器法出现不可接受结果的原因尚无文献阐述，是否与药物本身有关还需要进一步实验证实。

VITEK仪器法药敏试验采用的是微量MIC法，使用预先包被好含不同抗菌药物的药敏卡，其良好的操作性、重复性与时效性广受实验室欢迎，但短时间的试验结果可能导致细菌生长不全造成的假敏感现象，这可能是Hebarin数据中VITEK仪器法耐药率低于纸片法的原因。我国目前采用CLSI推荐的药敏方法，对于普通药敏试验推荐的判读结果时间为18～24 h，对于仪器法的这种现象是否可以通过延长培养孵育时间来解决，还有待进一步研究。

本研究发现无论是Hebarin数据还是本次实验药敏结果，纸片法的CA、MIE、ME、VME均在可接受范围，而VITEK仪器法在哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星几种药物上则不同程度出现不可接受的结果。对比本实验中E试验法、纸片扩散法、VITEK仪器法的药敏结果和CA结果，提示临床实验室工作人员在做药敏试验中，除应用比较便捷的VITEK仪器外，针对部分有疑问的结果还应辅以其他方法进行确认试验，得出准确的抗菌药物敏感性，指导临床合理用药，保证耐药性监测网的数据质量，使其在监测菌株耐药趋势及合理使用抗生素上发挥更为重要的作用。

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Susceptibility of Acinetobacter baumannii isolates to eight antimicrobial agents tested by different methods

WEN Hainan, XIE Shoujun, ZHAO Jianhong, SUN Qian, WEI Honglian, SHI Dongyan, LI Zhirong, XU Li, WEN Haifeng.
（Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde Hebei 067000, China）

ObjectiveThe purpose of this study was to analyze the susceptibility profile ofAcinetobacter baumanniito antimicrobial agents, and validate the results of different antimicrobial susceptibility testing methods, for improving the quality of antibiotic resistance monitoring data.MethodsThe susceptibility data of Hebei Provincial Antimicrobial Resistant Investigation Net were analyzed retrospectively and 126 strains ofA. baumanniiwere collected. The susceptibility ofA. baumanniito piperacillintazobactam, amikacin, gentamicin, ciprofloxacin, levofloxacin, ceftazidime, imipenem, and meropenem was tested by E-test, Kirby-Bauer method and VITEK system.ResultsThe susceptibility results of the 126A. baumanniistrains showed that the susceptibility to piperacillin-tazobactam, amikacin, gentamicin, levofloxacin and ceftazidime was significantly different between the three methods (P＜0.05). The categorical agreement, major error,minor error, and very major error of Kirby-Bauer method were within acceptable range. There were evident difference in classification consistency for piperacillin-tazobactam, amikacin,levofloxacin between Kirby-Bauer method and VITEK(P＜0.05).ConclusionsDifferent antimicrobial susceptibility testing methods may lead to different results of resistance monitoring data. Bias may be generated in antibiotic resistance surveillance if different methods are used. The susceptibilityresults of piperacillin-tazobactam, amikacin, levofloxacin derived from VITEK system should be validated by Kirby-Bauer or E-test method.

Acinetobacter baumannii; E-test; Kirby-Bauer method; VITEK

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0680-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.013

河北省科技厅基础条件平台建设项目（河北省医学微生物菌种资源标准平台建设10966142D）。

1. 承德医学院附属医院检验科，河北承德 067000；2. 河北医科大学第二医院检验科；3. 河北省临床检验中心；4. 沧州市人民医院检验科；5. 河北医科大学第三医院检验科。

温海楠（1987—），女，硕士，主管检验师，主要从事临床微生物感染与细菌耐药研究。

赵建宏，E-mail：zhaojh_2002@yahoo.com。

2017-03-30 修回日期：2017-05-14