冬凌草种子检验规程研究

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(河南中医药大学 药学院， 郑州 450008)

冬凌草种子检验规程研究

杨朝帆，李晓婷，董诚明

(河南中医药大学 药学院， 郑州 450008)

[目的]为了规范中药材种子市场，保证中药材种子的质量，制定冬凌草种子检验规程。[方法]通过对冬凌草种子扦样、千粒重、发芽率、含水量、生活力等常规指标的不同检测条件及检测方法进行对比分析，找出适合冬凌草种子的检验方法。[结果与结论]制定出冬凌草种子检验规程。

冬凌草； 种子质量； 检验规程

冬凌草为唇形科植物碎米桠(Rabdosiarubescenss(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分，在夏、秋二季茎叶茂盛时采割，晒干，具有清热解毒，活血止痛的功效[1]。种子质量是促进农业生产发展的重要保证，种子检验是保证种子质量的主要手段。中药材种子的质量是提高中药产品产量、品质的基础。目前，我国可栽培的中药材品种有200多种，只有少数品种如柴胡、三七、青蒿等中药材种子有相应的检验规程标准，其中大多数中药材的种子还没有相应的检验标准,无法对市场上的中药材的种子质量进行检验以及有效控制。本实验对冬凌草种子检验规程的方法及其各项检测指标进行了研究，制定出冬凌草种子检验规程。

1 实验材料

冬凌草是重要的药用资源之一，主产于我国河南、山西、湖南、湖北、四川、贵州等地。本实验冬凌草种子来源于河南济源枣庙冬凌草规范化基地资源圃，2015年11月采收2份种子，分别命名为JY 1、JY 2。经董诚明教授鉴定为冬凌草种子。

2 实验方法

2.1 扦 样[2]

按照GB/T 3543.2—1995《农作物种子检验规程》进行扦样。

2.2 种子净度分析[2]

按照GB/T 3543.1—1995《农作物种子检验规程》进行净度分析。

2.3 发芽测定

2.3.1 吸胀处理

扦样法分取的冬凌草种子用万分之一天平称取约0.5 g，放入蒸馏水中室温下浸泡，分别在1，2，4，6，8，10，12，24 h时取出用吸水纸吸干表面水分，称重并记录，直至恒重，得其最佳吸胀时间。

2.3.2 发芽温度的选择

发芽温度：设定恒温15，20，25，30，35 ℃等5个温度处理。在此次实验中采用通用发芽床(纸床)，在实验过程中保持滤纸湿润，且每天观察并记录种子的发芽率。通过分析、比较选择最佳的发芽温度。

2.3.3 消毒处理

消毒方法：75%乙醇浸泡1 min、2%次氯酸钠溶液浸泡15 min、1%的高锰酸钾溶液浸泡15 min 3个处理，每天记录、观察各处理种子的发芽率、霉变率，通过比较、分析选择最佳的消毒方法。

2.3.4 发芽床的确定

设定纸上、纸间、砂土、海绵等4种发芽床，在最佳吸胀时间、最佳发芽温度条件进行发芽试验。每天观察并记录种子的发芽率，确定冬凌草种子的最佳发芽床。

2.3.5 发芽的首末次计数时间的确定

在最佳吸胀时间、最佳发芽温度、最佳消毒方法、最佳发芽床的条件下进行发芽试验，观察、记录冬凌草种子每天的发芽情况，确定冬凌草种子的首末次发芽时间。

2.4 真实性鉴定

种子外观形态特征是植物最稳定的性状之一，通过对种子表面特征如颜色、大小、形态等的观察，可鉴定种子的真实性。鉴定依据：冬凌草种子为小坚果，每个果萼中有3～4粒种子，倒卵形，长1.42～1.65 mm；宽1.00～1.10 mm，种皮革质，表面光滑无毛色泽为浅棕色至褐色或有白色花纹，种子顶端呈近椭圆形，种子基端(着生种脐的一端)有隆起的种阜，种脐呈疣状突起，种孔位于种阜尖端，尖端为灰白色，种阜周围有明显的晕环，呈深色，明显深于种皮颜色，种子饱满的种皮为白色花纹。

2.5 含水量测定[2]

冬凌草种子水分测定采用高恒温烘干法测定。按照GB/T 3543.6—1995《农作物种子检验规程》水分测定执行。

2.6 生活力的测定[2]

按照GB/T 3543.7—1995《农作物种子检验规程》其他项目检测中种子生活力测定执行。冬凌草种子生活力测定方法：种子在室温下用蒸馏水浸泡6 h；将切开的种子置于0.5%四唑溶液中，于30 ℃恒温染色4 h，迅速用自来水冲洗干净。根据种子的染色情况记录冬凌草种子有、无生活力种子的数目。

2.7 重量测定

千粒重是衡量种子活力的重要指标，也是正确计算种子播种量的必要依据。按照GB/T 3543.7—1995《农作物种子检验规程》其他项目检验中重量测定执行。

2.8 种子健康状况检测[4]

按照GB/T 3543.7—1995《农作物种子检验规程》其他项目检测中种子健康度检查执行。

2.8.1 种子外部带菌检测

参照淡红梅[4]的方法检测种子外部带菌情况。

2.8.2 种子内部带菌检测

将预先处理的种子蒸馏水浸泡1～2 h后，用2%NaClO溶液浸泡15 min后无菌水冲洗3遍，参照淡红梅[4]的方法进行。

由图8可以看出两者存在较强的相关性(经计算得其相关系数为0.529)。在无法求得重建误差的情况下,可以用距离误差估计重建结果的好坏。

2.8.3 种子带菌鉴定

将从冬凌草种子外部、内部分离到的真菌分别进行纯化、镜检和转管保存。根据真菌的培养性状以及形态特征进行鉴定。

3 结果分析

3.1 扦 样

冬凌草种子批的最大重量为10 000 kg，种子净度分析实验中送检样品的最小重量为1.6 g(至少含有2 500粒冬凌草种子)，送检样品的重量至少为16 g(应超过净度分析的10倍)。

3.2 净度分析

种子批中种子包括杂质、其他种子及净种子，种子的增失差都小于5%，则检验结果有效，冬凌草种子净度分析结果见表1。

表1 冬凌草种子净度分析结果

编号杂质(%)其它种子(%)净度(%)增失差(%)JY13.65510.127796.21711.1213JY21.24190.128898.62922.4026

3.3 发芽率测定

3.3.1 吸胀处理

冬凌草种子质量在0～4 h变化比较大，4 h后变化缓慢，6 h后基本不变，可认为种子已吸胀饱和，因此选取6 h作为冬凌草种子的最佳吸胀时间。结果见图1。

图1 冬凌草种子吸胀线形图

3.3.2 发芽温度的选择

冬凌草种子在5个不同温度(15，20，25，30，35 ℃)下，发芽差异性较显著。在前4个温度(15，20，25，30 ℃)下种子的发芽率无显著差异；而在35 ℃温度下其发芽率最低，与其它温度下发芽率有显著差异。在25 ℃条件下发芽率最高达到95%，始发芽天数1 d，且发芽最整齐，因此选择25 ℃作为冬凌草种子的最佳发芽温度。结果见表2。

表2 不同发芽温度下的发芽情况

温度(℃)始发芽时间(d)平均发芽率(%)标准差(S)变异系数(CV)差异显著性15289.332.51662.8171a20192.671.52751.6484a251951.15471.2506a301922.64572.8758a35165.677.234111.0165ab

3.3.3 发芽前消毒处理

冬凌草种子在发芽过程中，易受霉菌的侵染影响发芽潜力，发芽前的清洁处理很有必要。发芽前分别用75%乙醇浸泡1 min、2%次氯酸钠溶液浸泡15 min、1%的高锰酸钾溶液浸泡15 min和直接用蒸馏水冲洗，10 d后统计发芽情况。发芽情况：75%乙醇溶液效果较差且推迟种子的发芽时间；1%KMnO4效果比较好；2%次氯酸钠对抑制种子发霉效果最佳；水冲洗效果最差。考虑方便、安全、经济等多方面因素，选2%次氯酸钠溶液浸泡15 min作为冬凌草种子最佳消毒处理方法。发芽情况见表3。

表5 不同染色时间下的染色结果

染色情况 0.1% 0.3% 0.5% 1.0% 1h2h3h4h1h2h3h4h1h2h3h4h1h2h3h4h完全染色4406004835845661部分染色6234661035242332完全不染色8370445240023110

表3 不同消毒处理对冬凌草种子发芽率和霉变率的影响

参数75%乙醇1%KMnO42%NaClO水冲洗始发芽所需时间(d)211110d后霉烂率(%)255140消毒效果(%)759599—10d后发芽效果(%)56768760

3.3.4 发芽床的选择

冬凌草种子在不同发芽床上发芽率差异并不显著，而纸上发芽床发芽率最高、发芽整齐、始发芽时间短、水分保持情况较好且易于操作，因此选择纸上发芽床为最佳发芽床。不同发芽床发芽情况见表4。

表4 不同发芽床对冬凌草种子发芽率的影响

发芽床始发芽时间(d)平均发芽率(%)标准差(S)变异系数差异显著性纸间发芽床185.332.51662.9492a砂床286.333.78594.3853a海绵床185.331.15471.3532a纸上发芽床1931.00001.0752a

3.3.5 发芽的首末次计数时间

冬凌草种子在第1天时已经开始发芽，到第2天3份样品的发芽率均达到了30%以上，因此可选择第2天作为冬凌草种子首次发芽计数时间；在第5天时发芽率达到最高，以后发芽率不再发生较大变化，因此建议第6天作为冬凌草种子发芽末次计数时间。选择第2、6天作为冬凌草种子的首末次计数时间。发芽时间见图2。

冬凌草种子发芽实验条件：种子先浸泡吸胀6 h，2%次氯酸钠溶液浸泡15 min消毒，在纸上发芽床上于25 ℃恒温培养箱(12 h光照/12 h黑暗)中培养6 d，发芽床保持湿润，第6天记录发芽情况，即为发芽率。

图2 发芽首末次计数时间

3.4 含水量测定

采用高恒温烘干法测定。冬凌草种子在最初的1 h内迅速失水，之后缓慢失水；待种子烘干到4 h以后，种子的含水量基本不变，故选择烘干时间为4 h。见图3。

图3 冬凌草种子失水重量的变化与烘干时间的关系

3.5 生活力测定

3.5.1 染色浓度和时间

冬凌草种子随着染色时间和染色浓度的增加，染色效果越好，但是实际观察中浓度越大，染色越深，颜色过深不利于观察判别且浓度越高毒性越大，0.5%的四唑溶液染色4 h效果最好(见表5、图4)，因此采用0.5%的四唑溶液染色4 h作为冬凌草种子生活力测定的方法。

3.5.2 染色鉴定标准

冬凌草种子生活力鉴定标准[4]：

图5 冬凌草有活力的种子

图6 冬凌草无活力的种子

图4 不同染色时间和染色浓度下的染色情况

有生活力的种子(见图5)：胚和子叶全部均匀染色(图5-a)；子叶远胚根≤1/3不染色，其余部分完全染色(图5-b)；子叶侧边总面积≤1/3不染色，其余部分完全染色(图5-c、图5-d)。

无生活力的种子(见图6)：胚和子叶完全不染色；胚和子叶染色不均匀，其上有斑点状不染色(图6-e)；子叶不染色面积占总面积的1/2(图6-f)；子叶近胚根处或胚根不染色(图6-g)；胚所染颜色异常，且组织软腐(图6-h)。

3.6 重量测定

千粒法测定冬凌草种子千粒重，千粒法2次重复之间的误差为1.19%，<5%，结果有效(见表6)。

表6 冬凌草种子千粒重

编号千粒重(g)标准差(S)两组重复之间的误差范围(%)10.501420.50400.00301.19

3.7 种子健康状况

检测出冬凌草种子所携带菌种主要为青霉属、曲霉属、毛霉属、链格孢属、头孢霉属等真菌，大部分真菌为空气中常见菌属，因此可考虑种子中携带菌与其本身生长环境之间的关联性(见表7、表8)。

表7 种子外部带菌检测

编号带菌率(%)真菌种类和分离比例(%)青霉属曲霉属毛霉属头孢霉属其它13.4957.14—28.5714.29—22.4333.2614.2951.43—1.0234.3150.23—46.51—3.26

表8 种子内部带菌检测

编号带菌率(%)真菌种类和分离比例(%)毛霉属青霉属曲霉属链格孢霉属其它12.6114.295012.50—5.4822.4225.8149.19—18.756.2533.5839.2443.2517.51——

4 讨 论

目前，冬凌草人工引种驯化已取得了初步成功，但关于其种子特性、种子质量标准的研究报道比较少。孔四新等[3]曾对冬凌草种子质量形成的相关因子、标准化生产技术进行了研究，但未系统地对冬凌草种子质量相关因子的检验技术进行筛选和优化。

冬凌草种子作为冬凌草植株更新换代的有性繁殖体，在中药材的生产过程中起着重要的作用。由于冬凌草种子成熟期不一致，造成了种子质量不均一，在实际的生产中如不区分种子的优劣而直接播种往往会造

Study on Seed Testing Regulations ofRabdosia

YANGChaofan，LIXiaoting，DONGChengming

2016-11-26

杨朝帆(1992—)，女，河南许昌人；在读研究生，研究方向：中药材规范化种植。

董诚明(1963—)，男，教授，研究方向：中药材规范化种值研究；E-mail:dcm371@hactcm.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.119

S 567

A

1001-4705(2017)04-0119-05