家养双峰驼SRY基因的序列分析与拷贝数研究

陈慧玲，任战军，叶翔杨，赵纪萍，张成东

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨陵 712100)

家养双峰驼SRY基因的序列分析与拷贝数研究

陈慧玲，任战军，叶翔杨，赵纪萍，张成东

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨陵 712100)

为探究中国家养双峰驼SRY基因的序列以及群体间拷贝数变异，对7个中国家养双峰驼群体共94个个体的SRY基因部分序列进行测序，分析SRY基因序列与其他物种的相似性；并且以 CYP2A基因为内参基因，运用实时荧光定量PCR技术检测SRY基因的拷贝数。结果表明，中国家养双峰驼与人、马、猪、羊及普通牛的SRY基因相似度分别为67.7%～68.1%、68.5%～69.4%、73.8%～74.4%、73.8%～74.8%、74.1%～74.8%。在家养双峰驼SRY基因的多个拷贝中，除1个拷贝外，其余拷贝的HMG序列与羊驼、人、马、猪、绵羊及普通牛的HMG序列相比，相似度分别为97.3%、84.2%、85.6%、86.3%、87.0%、85.6%。SRY基因在中国家养双峰驼Y染色体上以多拷贝形式存在，变幅为 1～9 个拷贝。表明中国家养双峰驼SRY基因的HMG序列是高度保守的，而且该基因属于多拷贝基因。

家养双峰驼；SRY基因；拷贝数

性别决定基因(Sex-determining-region on Y chromosome,SRY)存在于哺乳动物Y染色体的雄性特异区，具有性别决定功能，参与睾丸组织的发育过程。该基因编码的蛋白包含C端、N端和高泳动类非组蛋白(High-mobility group, HMG)区域，C端与N端在物种间保守性较弱，而HMG区域在物种间具有高度保守性[1-2]。早期对SRY基因的研究发现，SRY保守区的突变会破坏其雄性性别决定功能，引起性别反转[3-4]，SRY基因也能够诱导基因型为XX的雌性小鼠向雄性发育[5]。SRY蛋白能够识别并结合 SOX9(Sry-related HMG box-9)基因上游的增强子[6]，使睾丸支持细胞的前体细胞中 SOX9基因的转录水平显著上调，进而促进下游基因的转录，诱导睾丸支持细胞的分化。随后，分化后的睾丸支持细胞组装成睾丸索，并且刺激生殖细胞、睾丸间质细胞、睾丸血管细胞以及其他间质细胞的分化，最终形成睾丸组织。

在多数哺乳动物中，SRY基因是以单拷贝的形式存在[7]，但是少数物种中该基因存在多拷贝现象。猫、小鼠、家兔和水牛中SRY为多拷贝基因[8-12]。接触辐射或性染色体异常的人类SRY基因会出现拷贝数变异现象[13]。迄今为止，未见中国家养双峰驼SRY基因研究的报道。本试验以中国4个地区7个家养双峰驼群体为研究对象，对其SRY基因部分序列进行测序，并且运用实时荧光定量PCR技术检测其拷贝数，以期对家养双峰驼SRY基因有初步了解。

1 材料与方法

1.1 试验材料

按照随机整群抽样的方法，采集内蒙古(阿拉善、苏尼特)、甘肃(河西)、青海(海西州)、新疆(南疆、北疆和东疆)4个地区94峰雄性家养双峰驼的血样(表1)。另外，采集5峰雌性家养双峰驼血样作为阴性对照。颈静脉采集血液于已灭菌的离心管中，加入ACD抗凝剂后在-80 ℃保存，备用。

表1 家养双峰驼样本来源与样本量Table 1 Source and number of domestic bactrian camel

1.2 SRY引物设计与合成

依据GenBank数据库中雄性野生双峰驼的相应序列(GenBank登录号:NW_006220067)，运用Primer 5.0软件设计预期扩增片段长度为708 bp 的引物用于SRY基因的测序。其中上游引物：5′-ATGCTTCTGCTATGTTTGCG-3′，下游引物：5′-ACCAAAAGTAACGGTGAGAATG-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 PCR扩增与测序

利用酚—氯仿法提取基因组DNA[14]，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测其纯度和质量浓度。将提取效果良好的基因组DNA样品统一稀释至20 ng/μL，置于-20 ℃保存，备用。

挑选6～10个雄性个体的基因组DNA混合成DNA池，共构建13个DNA池，-4 ℃保存。DNA池中每个样品的质量浓度尽可能保持一致。

首先用SRY引物对雄性DNA池进行PCR扩增(以雌性双峰驼DNA为阴性对照)，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测引物的雄性特异性，并且确定其最适退火温度为65.3 ℃。反应体系为10 μL：EsTaqMaster Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 4.1 μL(北京康为世纪有限公司)。 PCR反应程序：95 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s， 72 ℃ 50 s，34个循环；72 ℃ 10 min。雄性特异的扩增产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

如果测序结果出现双峰，则对该DNA池中的每个个体分别进行PCR扩增测序，以再次确定SNP位点。如果单个个体的序列峰图仍在相同位点处出现双峰，则需要进行TA克隆测序予以验证。在每个群体中分别挑选1个个体进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Takara公司)纯化回收PCR产物，产物经过纯化与回收之后，与pGEM-T载体连接，然后转化至大肠杆菌感受态细胞，在37 ℃平板培养。每个个体随机挑选10个阳性菌落在具有Amp+的LB培养基中震荡培养过夜，吸取部分菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序。

1.4 SRY序列相似性分析

用DNASTAR软件对所有个体的序列进行比对，分析个体间序列的差异。运用MegAlign软件分析人(GenBank登录号:JQ811934.1)、马(GenBank登录号:NM_001081810.1)、猪(GenBank登录号:U49860.3)、绵羊(GenBank登录号:Z30265.1)及普通牛(GenBank登录号:Z30327.1)的SRY基因序列与测序所得的SRY基因部分序列的相似度以及物种间HMG区DNA序列的相似度。

1.5 荧光定量引物的设计与合成

TA克隆测序完成后，运用MegAlign软件比对所有序列，选择在SRY基因的保守区设计SRYa引物用于实时荧光定量PCR扩增。选择常染色体上的单拷贝基因细胞色素P4502A( CYP2A)为内参基因[14]，计算SRY基因的拷贝数。引物信息见表2。

1.6 荧光定量PCR扩增

采用实时荧光定量PCR技术检测基因的拷贝数。首先挑选质量较好的DNA模板用于标准曲线的制作，质量浓度梯度依次为40、20、10、5和2.5 ng/μL，每个质量浓度设置3个重复。荧光定量PCR程序完成之后，获得各质量浓度相对应的Ct值，分别制作CYP2A和SRYa的标准曲线。将待测样本均稀释至5 ng/μL，每个样本在同一板中同时进行2对引物的扩增，而且每对引物对应的每个DNA样本均设置3个重复，每板都设有相同的校正样本以减小板间的系统误差。

表2 SRYa和CYP2A引物信息Table 2 Information of SRYa and CYP2A

反应体系：DNA模板0.8 μL，SYBR Premix EXTaqⅡ(2×)(Takara) 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，RNase-Free Water 3.4 μL。荧光定量反应程序为：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，退火30 s，35个循环；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，65 ℃～95 ℃(0.5 ℃/s)。

1.7 基因拷贝数的计算

参照HAMILTON等[15]的方法计算SRY基因的拷贝数。计算公式如下：

依据获取的各质量浓度梯度所对应的Ct值，绘制标准曲线，可以获得标准曲线的斜率k，进而计算出引物的扩增效率：E=10-1/k。

依据所有96孔板中校正样本的Ct值，计算校正样本Ct值的平均值。再根据平均值计算校正样本的拷贝数：CN校正样本=(Er)Ct r/(Et)Ct t。

每个96孔板中校正样本都设置3个重复，分别计算不同板中校正样本3个Ct值的平均值，再将不同板的待测样本校正到同一水平，待测样本与校正样本之间校正系数的计算：

R=(Et)△Ct t/(Er)△Ct r。

待测样本拷贝数计算：CN=(CN校正样本) ×R。

k代表标准曲线的斜率，t代表目的基因SRY，r代表内参基因 CYP2A，E代表扩增效应，Et代表SRYa引物的扩增效率，Er代表CYP2A 引物的扩增效率，Ctr代表CYP2A引物的Ct值，Ctt代表SRYa引物的Ct值，△Ctt=校正样本SRYa的Ct值-待测样本SRYa 的Ct值，△Ctr=校正样本CYP2A 的Ct值-待测样本CYP2A 的Ct值。

运用SPSS 18.0软件Kolmogorov-Smirnov标准对所研究个体的基因拷贝数进行正态分布检验。

2 结果与分析

2.1 SRY基因的PCR扩增

Touchdown PCR扩增后，扩增产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，阴性对照与空白对照无扩增产物，而所有雄性个体的条带明亮清晰，片段长度与预期长度一致，并且无非特异性扩增，表明SRY引物具有雄性特异性。

图1 SRY引物的雄性特异性检测Fig.1 Detection of SRY specificity in male camel

2.2 SRY基因序列分析

运用DNASTAR软件对SRY引物扩增所得序列进行比对，结果如图2所示，13个DNA池中SRY基因扩增片段的测序峰图均出现双峰，本图只展示其中3个DNA池的比对结果，其余DNA池测序结果与该图一致，因此初步推断SRY基因存在SNP位点以及碱基的插入。

以DNA池中各单样为模板分别对SRY引物进行PCR扩增并对扩增产物测序，经过序列比对，对应DNA池中SNP位点处寻找各个单样之间碱基的差异。结果如图2所示，每个个体的测序峰图在与池DNA序列的相同位点处存在双峰，而且也具有碱基插入位点，其他个体测序结果也与该结果一致，由此推测在家养双峰驼中SRY基因可能是多拷贝基因。

TA克隆测序结果如图3所示，同一个体10个克隆之间的序列存在变异位点和1个AT二碱基插入，本图只展示3个克隆序列的比对结果，其他群体的测序结果与青海驼一致。由于Y染色体MSY区不与X染色体重组，因而证明在家养双峰驼中单个个体出现SNP位点的SRY基因是多拷贝基因。

图2 3个DNA池的SRY基因测序Fig.2 Sequencing result of the SRY gene of three gene pools

图3 1峰青海驼的SRY基因克隆测序Fig.3 SRY gene of a Qinghai sample by PCR cloning and sequencing

2.3 不同物种间序列相似性分析

对中国家养双峰驼的SRY基因部分序列进行克隆测序，共获得708 bp的序列。运用MegAlign软件对家养双峰驼SRY基因不同拷贝的序列与人、马、猪及普通牛的SRY基因序列进行比对分析，结果发现，中国家养双峰驼SRY基因与人、马、猪、绵羊及普通牛的SRY基因相似度约为67.7%～68.1%、68.5%～69.4%、73.8%～74.4%、73.8%～74.8%、74.1%～74.8%。

不同物种的SRY蛋白都含有保守的HMG结构域，该结构域是SRY蛋白重要的功能区。因此本试验比对羊驼HMG序列和家养双峰驼708 bp 的序列，结果显示在家养双峰驼SRY基因的多个拷贝中，除1个拷贝外，其余拷贝中有146 bp的序列与羊驼HMG序列相似度高达97.3%，与人、马、猪、绵羊及普通牛的HMG序列相比，相似度分别为84.2%、85.6%、86.3%、87.0%、85.6%。因此，可以初步确定中国家养双峰驼SRY基因的HMG区域。由于拷贝之间的HMG序列有5个突变位点，因而认为家养双峰驼的HMG序列为：

TCATTGTATGGGCTCGTGATCAAAGGCGAAAGGTGGCTCTASAGAATMCCAAA- ATGCAGAACKCAGAGATCAGCAAGCGGC-TGGGATACCAGTGGAAATTACTTACAGA-AGSTGAAAAGCGGCCGTTCTTCGAGGAG-GCRCAGAGA。

结合野生双峰驼SRY基因的预测序列、氨基酸序列(GenBank登录号:XP_006195462)以及羊驼HMG的氨基酸序列(GenBank登录号:ABI31754.1)，推测家养双峰驼HMG的氨基酸序列为：

IVWARDQRRKVAL(E/Q)N(T/P)KMQN(A/S)EISKRLGYQWKLLTE(A/G)EKRPFFEE AQR。其与野生双峰驼和羊驼序列相似度约为95.8%。

2.4 SRYa和CYP2A引物的PCR扩增

Touchdown PCR扩增后，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测(图4)，结果显示SRYa引物只在雄性个体中有目的条带，雌性个体无条带。CYP2A引物的扩增产物为单一条带，且无引物二聚体。

图4 SRYa(a)和CYP2A(b)引物的特异性检测Fig.4 Detection of SRYa(a) and CYP2A(b) specificity

2.5 溶解曲线

引物的荧光定量溶解曲线如图5所示，2对引物的扩增产物单一，无引物二聚体及非特异性条带扩增。由此可见，该引物均可用于后续的荧光定量PCR扩增。

2.6 标准曲线

CYP2A和SRYa引物的标准曲线如图6所示，CYP2A和SRYa引物的标准曲线斜率分别为-3.207 1和-3.223 3。由此计算出CYP2A和SRYa引物的扩增效率分别为2.05和2.04，R2均大于0.99，表明2对引物的扩增效率较好，可用于后续的试验。

2.7 拷贝数计算

根据公式计算出校正样本SRY基因的拷贝数是2，随后计算94个样本的拷贝数。结果显示，在94个个体中，SRY基因拷贝数中值数为4，变幅为1～9。各群体拷贝数见表3。

图5 CYP2A和SRYa的 qPCR 溶解曲线Fig.5 Dissociation curves of CYP2A and SRYa

图6 CYP2A 和SRY扩增引物的标准曲线Fig.6 Standard curves of CYP2A and SRY primers

表3 7个家养双峰驼群体SRY基因的拷贝数中值Table 3 Copy median number (CN) of SRY in seven populations

94个个体基因拷贝数的正态分布分析结果显示所有个体的拷贝数均不服从正态分布(图7-a)。箱线图结果发现少数双峰驼个体的SRY基因拷贝数偏高或偏低，大约占群体的1.06%。其中，苏尼特骆驼有1个个体与其他个体离散，拷贝数为9(图7-b)。

3 讨 论

平均值=4.11，标准差 = 1.44 Mean = 4.11,standard deviation = 1.44

SRY基因是哺乳动物性别决定的开关基因，它的表达能够启动雄性发育的级联信号通路，诱导性别特异的性腺发育，因而在物种的性别分化过程中具有至关重要的作用。本试验通过对中国家养双峰驼的SRY基因部分序列进行测序，而后将所得序列与其他物种SRY基因序列进行比对，结果显示其与牛和猪的相似度很高。Jirimutu等[14]通过对动物基因组中的 2 345 个单拷贝直系同源构建系统进化树，结果发现骆驼与牛和猪的关系最近。虽然本试验所研究的SRY基因是多拷贝基因，但是物种间的序列相似度也能在一定程度上反映骆驼与牛、猪的进化关系，进化关系越近，序列变异程度越小。因此，该结果与Jirimutu等[14]的研究结果一致。

本试验运用实时荧光定量PCR技术检测中国家养双峰驼SRY基因的拷贝数，结果发现拷贝数变幅为1～9。和其他物种相比，拷贝数也有差异。目前研究发现，SRY基因在人类、马、牛、黑猩猩、猪中均为单拷贝基因[7,15-17]，而在家猫和水牛中则为多拷贝基因[10,12]。大鼠的SRY基因有11个拷贝，拷贝序列之间有一定的差异[11]，11个拷贝中至少有6个拷贝能够正常表达[18]。不同物种拷贝数的差异进一步表明Y染色体在不同的物种间表现出异质性。

HMG区域在物种间相对保守，是SRY基因发挥性别决定功能的区域。因此，本试验对中国家养双峰驼SRY基因的HMG区域进行预测，结果显示，HMG的碱基序列位于本试验所扩增片段的193～338 bp，而二碱基插入在该区域的下游，因而不会引起该区域序列的移码突变。由于不同拷贝的序列之间有变异位点存在，部分氨基酸会发生改变，氨基酸的改变是否会影响SRY基因的功能还是未知数。目前，对于大鼠SRY基因序列的分析结果显示，11个拷贝的SRY序列之间的突变位点导致氨基酸序列改变，进而引起核定位以及转录活性改变[11]。前人[19-20]研究发现SRY蛋白的功能并不局限于性别决定，其在成年雄性大脑、肾脏和肾上腺中也有表达。本试验所得708 bp的序列在拷贝序列间也存在多个突变位点及1个二碱基的插入位点，推测这些位点的改变可能会影响睾丸组织的发育。这些变异也可能与SRY基因的其他功能相关联，然而这些问题还有待于进一步探讨。

Reference：

[1] LUNDRIGAN B L,TUCKER P K.Tracing paternal ancestry in mice,using the Y-linked,sex-determining locus,Sry[J].MolecularBiologyandEvolution,1994,11(3):483-492.

[2] NACHMAN M W,AQUADRO C F.Polymorphism and divergence at the 5’ flanking region of the sex-determining locus,Sry,in mice[J].MolecularBiologyandEvolution,1994,11(3):539-547.

[3] HARLEY V R,JACKSON D T,HEXTALL P J,etal.DNA binding activity of recombinant SRY from normal males and XY females[J].Science,1992,255(5043):453-456.

[4] HAWKINS J R,TAILOR A,BERTA P,etal.Mutational analysis of the SRY:nonsense and missense mutations in XY sex reversal[J].HumanGenetics,1992,88(4):471-474.

[5] KOOPMA P,GUBBAY J,VIVIAN N,etal.Male development of chromosomally female mice transgenic for SRY[J].Nature,1991,351(6322):117-121.

[6] SEKIDO R,LOVELL-BADGE R.Sex determination involves synergistic action of SRY and SF1 on a specific SOX9 enhancer[J].Nature,2008,453(7197):930-934.

[7] PARIA N,RAUDSEPP T,WILKERSON A J P,etal.A gene catalogue of the euchromatic male-specific region of the horse Y chromosome:comparison with human and other mammals[J].PLoSOne,2011,6(7):e21374.

[8] TOURE A,SZOT M,MAHADEVAIAH S K,etal.A new deletion of the mouse Y chromosome long arm associated with the loss of Ssty expression,abnormal sperm development and sterility[J].Genetics,2004,166 (2):901-912.

[9] GERALDES A,FERRAND N.A 7-bp insertion in the 3′ untranslated region suggests the duplication and concerted evolution of the rabbitSRYgene[J].GeneticsSelectionEvolution,2006,38:313-320.

[10] WILKERSON A J P,RAUDSEPP T,GRAVES T,etal.Gene discovery and comparative analysis of X-degenerate genes from the domestic cat Y chromosome[J].Genomics,2008,92(5):329-338.

[11] PROKOP J W,UNDERWOOD A C,TURNER M E,etal.Analysis of SRY duplications on the Rattus norvegicus Y-chromosome[J].BMCGenomics,2013,14(1):117-124.

[12] 徐舒远.水牛Y-SNPs筛选及多拷贝基因鉴定[D].陕西杨陵:西北农林科技大学,2014.

XU SH Y.Y-SNPs scanning and multi-copy genes identification in water buffalo[D].Yangling Shaanxi:Northwest Aamp;F University,2014 (in Chinese with English abstract).

[13] PREMI S,SRIVASTAVA J,CHANDY S P,etal.Tandem duplication and copy number polymorphism of theSRYgene in patients with sex chromosome anomalies and males exposed to natural background radiation[J].MolecularHumanReproduction,2006,12(2):113-121.

[14] JIRIMUTU,WANG Z,DING G,etal.Genome sequences of wild and domestic bactrian camels[J].NatureCommunications,2012,3:1202-1202.

[15] HAMILTONA C K,FAVETTA L A,DI MEO G P,etal.Copy number variation of testis-specific protein,Y-encoded (TSPY) in 14 different breeds of cattle (Bostaurus)[J].SexualDevelopment,2009,3(4):205-213.

[16] SKALETSKY H,KURODA-KAWAGUCHI T,MINX P J,etal.The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes[J].Nature,2003,423(6942):825-837.

[17] CHANG T C,YANG Y,RETZEL E F,etal.Male-specific region of the bovine Y chromosome is gene rich with a high transcriptomic activity in testis development[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2013,110(30):12373-12378.

[18] TURNER M E,MARTIN C,MARTINS A S,etal.Genomic and expression analysis of multipleSRYloci from a single Rattus norvegicus Y chromosome[J].BMCGenetics,2007,8(1):1.

[19] CZECH D P,LEE J,SIM H,etal.The human testis-determining factor SRY localizes in midbrain dopamine neurons and regulates multiple components of catecholamine synthesis and metabolism[J].JournalofNeurochemistry,2012,122(2):260-271.

[20] DEWINGE P,CHIANG C W K,SINCHAK K,etal.Direct regulation of adult brain function by the male-specific factor SRY[J].CurrentBiology,2006,16(4):415-420.

CorrespondingauthorREN Zhanjun, male, associate professor. Research area:economic zoology research.E-mail:renzhanjun@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：顾玉兰Responsibleeditor:GUYulan)

CopyNumberandSequenceAnalysisofSRYGeneinChineseDomesticBactrianCamel

CHEN Huiling, REN Zhanjun, YE Xiangyang, ZHAO Jiping and ZHANG Chengdong

(College of Animal Science and Technology, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100,China)

The study aims to exploreSRYgene sequence of Chinese domestic bactrian camel and the copy number variation of SRY among populations. Partial sequence ofSRYgene of 94 samples from seven populations were sequenced to analyze the similarity among species. Additionally, CYP2A gene as a reference gene,SRYgene copy number was detected by real-time PCR. The similarity ofSRYgene between Chinese bactrian camel and human, horse, pig, sheep as well as bovine was 67.7%-68.1%, 68.5%-69.4%, 73.8%-74.4%, 73.8%-74.8% and 74.1%-74.8%, respectively. Except for one copy, the similarity between HMG of the rest copy of Chinese bactrian camel and HMG of alpaca, human, horse, pig, sheep as well as bovine was 97.3%, 84.2%, 85.6%, 86.3%, 87.0% and 85.6%, respectively. TheSRYgene was a multicopy gene in Chinese domestic bactrian camel and copy number variation ranged from 1 to 9. HMG sequences of Chinese domestic bactrian camel were highly conserved. TheSRYgene was a multicopy gene in Chinese domestic bactrian camel.

Domestic bactrian camel;SRYgene; Copy number

2016-09-20

2016-10-25

The National Natural Science Foundation of China (No. 31172178).

CHEN Huiling, female, master student. Research area:evaluation, protection and utilization of animal genetic resources. E-mail:chlachj@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-11-17

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.004.html

2016-09-20

2016-10-25

国家自然科学基金(31172178)。

陈慧玲，女，硕士研究生，从事动物遗传资源评价、保护和利用研究。E-mail:chlachj@nwsuaf.edu.cn

任战军，男，副教授，主要从事经济动物研究。E-mail:renzhanjun@nwsuaf.edu.cn

Q951

A

1004-1389(2017)11-1569-08