SSR标记技术鉴定‘新食葵7号’品种纯度的研究

柳延涛，段 维，王 波，刘胜利，王 鹏，赵 刚

(1.新疆农垦科学院 作物所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地种业科技股份有限公司，乌鲁木齐 830011)

SSR标记技术鉴定‘新食葵7号’品种纯度的研究

柳延涛1，段 维2，王 波1，刘胜利1，王 鹏1，赵 刚1

(1.新疆农垦科学院 作物所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地种业科技股份有限公司，乌鲁木齐 830011)

以‘新食葵7号’及其双亲的DNA为模板，对100对SSR引物进行筛选，以期为生产应用提供准确、便捷的杂交种种子纯度鉴定方法。SSR多态引物标记521在‘新食葵7号’母本产生特异条带大小为482 bp，父本为447 bp；标记563在母本上特异条带大小为352 bp，父本为384 bp，分子鉴定的纯度和田间鉴定纯度基本一致，通过SSR引物筛选，得到可以区分父本、母本和杂交种的标记引物521和563，这2个引物标记可有效鉴定‘新食葵7号’杂交种种子的纯度。

向日葵；杂交种；品种纯度鉴定；SSR标记

向日葵(HelianthusannuusL.)是世界五大经济作物之一，具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄的特性，是中国北方地区的主要油料作物。国内从20世纪70年代开展三系杂交育种，杂交种已在生产中大面积推广应用。由于在向日葵三系杂交制种过程中很容易自交结实形成假杂种，影响品种杂种优势的发挥。此外，在大规模杂交制种过程中，由于父本收获不及时或不彻底，其自交结实的种子也很容易混进杂交种，从而造成种子纯度质量下降。因此，在向日葵杂交种销售之前必须进行严格的纯度鉴定。

目前，向日葵杂交种鉴定大多采用形态学方法，根据作物的形态特征和农艺特征鉴定特定的基因型，是一种基本的品种纯度检验方法，具有简单、直观、易观测记载等优点，但鉴定周期长，费用高[1-2]，属基因表达的间接鉴定。近年来，DNA多态性检测技术迅速发展，尤其是DNA多态性检测技术以其直接进行基因的分子鉴定，具有材料少、时间短、结果稳定性好、重复性高、技术简单、成本低的显著优点，逐渐成为检测的主要方法[3]。目前，SSR技术已广泛应用于玉米、水稻、大豆等其他作物的品种纯度鉴定，SSR最大的优点在于其扩增产物进行测序凝胶电泳分离时具有单碱基的高分辨率，能检测到很高的多态性，遗传信息量较大，并具有较好的稳定性和重演性[4-6]。本研究利用 SSR 标记技术对‘新食葵7号’进行纯度鉴定，旨在通过分子标记技术快速、稳定及准确鉴定‘新食葵7号’杂交种种子纯度，为向日葵育种和种子管理探索准确、便捷的杂交种种子纯度鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为‘新食葵7号’杂交种，及其母本‘BH3-Ⅱ12555’、父本‘XX2-u1111’样品；均由新疆农垦科学院提供。一份用于田间小区种植鉴定，一份用于SSR 标记技术鉴定。‘新食葵7号’是由新疆农垦科学院作物所选育的产量较高、综合经济性状好、抗逆性较强的中早熟食葵杂交种，2011年通过新疆维吾尔自治区农作物品种审定委员会审定。以‘新食葵7号’及其双亲的DNA为模板，进行SSR物分子标记的多态筛选。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 考虑到成本，试验选取600粒‘新食葵7号’种子，分成3个重复，每重复200粒，参照已报道的CTAB法提取DNA[7-8](这种方法是由Murray 和Thompson(1980)修改而成的简便方法)。食葵DNA快速提取试剂含100 mmol/L Tris-HCl pH 8，1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，pH 8， 2.74 mmol/L CTAB，20 mmol/L 2-巯基乙醇。

在大批量鉴定时，使用新疆康地种业科技有限公司设计的一套批量DNA提取方法(一种组合式磁性分离装置[9]，专利号：Z1201120272074.2)，利用该装置可以一次提取1～96个不同样品，并在DNA的质量上有所提高，极大地节约了人力成本和时间。

1.2.2 PCR扩增 扩增反应混样含5×反应缓冲液4 μL，25 mmol/L MgCl2溶液2 μL，0.1 mmol/L dNTPs溶液3 μL，1 μmol/L Primer溶液3 μL，5 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，1～5 ng模板DNA；反应总体积为20 μL，扩增程序为95 ℃变性2 min，94 ℃变性45 s、57 ℃退火45 s、72℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃延伸8 min。

1.2.3 胶板电泳 扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度100 g/L，待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；电泳缓冲液为1×TBE，使电泳缓冲液液面刚高出凝胶面，恒压电泳。

取4 mL上述“1.2.2”中PCR扩增反应缓冲液1 mL，含如下成分：2.5 g/L溴酚蓝，2.5 g/L二甲苯青，40 g蔗糖定容至0.1 L；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定(100.0 g/L乙醇、5.0 g/L冰乙酸)20 min；银染(2.0 g/L硝酸银水溶液)12 min；蒸馏水漂洗2次； 0.02 g/L硫代硫酸钠的水溶液漂洗；显色(15.0 g/L氢氧化钠、4.0 g/L甲醛)适度；在白色灯下DNA存在处显示出肉眼可辨的条带，于凝胶成像系统中拍照并保存。

1.3 田间小区种植鉴定方法

选取900粒向日葵种子，分成3个重复，每重复300粒，于同年冬天种植在海南三亚实验站，行距40 cm，株距15 cm。出苗后调查向日葵的整齐度等形态特征，计算品种的纯度。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

以‘新食葵7号’及其双亲的DNA为模板，对100对SSR引物分子标记进行筛选，获得能够同时区分父本、母本和杂交种的SSR多态引物标记521和563。利用该引物不仅可以鉴定出‘新食葵7号’杂交种样品中母本自交结实产生的假杂种，而且可以鉴定出由于收割不及时或不彻底等原因混进的父本假杂种。其序列如下。

标记521 ：5′-CACTGCAACACCTTTCCT- TT-3′；5′-AGGTAGCCTGACAAACAGATAAGG-3′。

标记563：5′-CATTGTGACCGATGGA- CGATA-3′；5′-GCACCAGTCCTCTTAGCGAA- T-3′。

2.2 ‘新食葵7号’杂交种的鉴定

利用筛选出的SSR多态引物标记521和563对‘新食葵7号’杂交种及亲本进行鉴定，选取部分条带图像(图1)。可以从图1看出，12个泳道从右到左分别是父本、母本、及F1杂交种。其中父本特异条带大小为482 bp，母本为447 bp；第10泳道表现为父本条带，表明该籽粒可能有制种田的种植父本混入。

1～9.‘新食葵7号’F1杂交种 Hybrid；10.混入‘新食葵7号’杂交种父本的F1Male parent mixed with hybrids；11.‘新食葵7号’母本 Maternal parent；12.‘新食葵7号’父本 Male parent

图1引物521扩增的SSR图谱
Fig.1TheSSRproductsamplifiedbytheprimer521

图2为SSR引物标记563扩增的‘新食葵7号’杂交种及亲本的图像，13个泳道从左到右分别是母本、父本、及F1杂交种。产生的母本特异条带大小为352 bp，父本为384 bp；第3和第5泳道表现为父本条带，表明该籽粒可能有制种田的父本混入。

通过对‘新食葵7号’亲本及杂交种SSR分子标记鉴定和田间鉴定相比较(表1)可以看出，其鉴定该品种的纯度和田间鉴定纯度基本一致，但SSR纯度鉴定结果比田间种植鉴定纯度低0.1%～0.8%，推测可能是在田间种植鉴定过程中，由于杂交种单株具有杂种优势，在有限的生长空间比假杂种更容易成活，从而造成鉴定结果偏高。利用SSR分子标记技术，除母本(包括不育系、保持系)、父本基因型外，其他遗传背景相似的单一基因位点很容易被鉴别出来，田间纯度鉴定主要以农艺性状为标准，遗传背景相似的杂交种难以鉴别，因此该引物可快速有效鉴定‘新食葵’杂交种种子的纯度，并且利用SSR分子标记技术也是一种准确、快速、便捷鉴定向日葵杂交种纯度的方法。

1.‘新食葵7号’母本 Maternal parent；2.‘新食葵7号’父本 Male parent；3～4和 6～13.‘新食葵7号’F1杂交种 Hybrid;5.混入‘新食葵7号’杂交种父本的F1Male parent mixed with the hybrid

图2引物563扩增的SSR图谱
Fig.2TheSSRproductsamplifiedbytheprimer563

表1 不同鉴定方法的结果比较Table 1 Comparison of the results of different identification methods

3 讨论与结论

从传统的形态鉴定、生化指纹检测发展到分子水平和基因水平检测杂交向日葵品种纯度的检验技术，经历从简单到复杂而精确的过程，每一种方法都有其各自的优点和不足。每一种向日葵杂交种纯度的鉴定方法在应用上都具有重要的意义。

目前，向日葵种子纯度鉴定主要是冬季在海南种植鉴定，需要经历播种、出苗和一定的生育期，因此田间鉴定时间长，海南种植异地鉴定费用高，而且通常在种子销售完后才得到鉴定结果。本试验基于PCR 技术，利用向日葵2个SSR分子标记完成对向日葵杂交种子纯度的鉴定，均在室内操作，过程快捷，结果准确、可靠，为向日葵杂交的种子纯度鉴定提供新思路。通过建立标准食葵DNA的提取方法，包括食葵SSR技术最佳程序，PCR扩增反应各组分的优化组合，以及扩增条带的显色程序；本研究以商品食葵品种‘新食葵7号’及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记521和563，这2个引物标记可有效鉴定‘新食葵7号’杂交种种子纯度，辨别种子真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快‘新食葵7号’商品种子的质量检测进程。

本研究结果表明，SSR标记技术表现为多态性好、灵敏度高，适于食葵种子的纯度鉴定，但是能否筛选到合适的引物是该方法成功应用的限制因素。建议在第一批引物设计的思路下，增加引物数量。对向日葵等作物纯度鉴定SSR核心引物资料目录索引，一些学者也作了相关研究[10-14]。另外，食葵亲本材料少，由于品种保护等原因，要收集到亲本种子越来越难，影响引物的筛选。所以建议收集更多的父母本材料，进行更大范围的引物筛选，扩大适应性，节约鉴定时间。

在使用过程中可以达到以下有益效果：(1)加快鉴定时间：建立食葵DNA提取、SSR技术，扩增效果稳定，省去繁杂的试剂配置和特定引物筛选进程。(2)特异性好：利用该引物分别对‘新食葵7号’的母本多次进行扩增，结果表明，各引物对各自模板均产生特异条带。(3)重复性好：用该引物进行多次重复性检测，结果表明，该方法具有很好的重复性。比田间小区种植鉴定的结果更真实和准确，试验结果也表明该方法多态性好、灵敏度高，非常适用于向日葵种子的纯度鉴定。但是存在一些不足之处，如开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高，因此，合成引物不易获得。

近年来，随着分子生物学快速发展，分子标记技术越来越广泛应用于作物育种、基因文库、DNA指纹等诸多领域，其中利用分子标记进行亲缘分析和品种纯度鉴定成为近期的研究热点。本文以‘新食葵7号’及其双亲为试验材料，采用SSR分子标记技术，对100对SSR引物分子标记进行筛选研究，以期为向日葵育种和种子管理探索准确、便捷的杂交种种子纯度鉴定方法。另外，此方法还有利于‘新食葵7号’杂交种种子高效准确的质量控制，对加快食葵商品种子的质量检测进程意义重大。

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CorrespondingauthorWANG Bo，male，associate research fellow. Research area:crop cultivation and physiology.E-mail:519392988@qq.com

(责任编辑：郭柏寿Responsibleeditor:GUOBaishou)

PurityIdentificationofSunflowerHybrid‘Xinshikui7’UsingSSRMarkersTechnique

LIU Yantao1, DUAN Wei2, WANG Bo1, LIU Shengli1, WANG Peng1and ZHAO Gang1

(1.Institute of Crop Research，Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Sciences,Shihezi Xinjiang 832000,China;2.Xinjiang Kangdi Seed Science amp; Technolog Co. Ltd., Urumqi 830011,China)

SSR molecular marker technique was used to provide accurate, convenient method for the identification of the purity of sunflower hybrid seeds in production and processing. With the DNA of ‘Xinshikui 7’ and its parents as template,100 pairs of SSR molecular markers were screened after DNA extraction, PCR amplification and electrophoresis production. The result showed that the SSR polymorphic primer marker 521 produced a specific band of 482 bp in the female parent, and a specific band of 447 bp in the male parent; the primer marker 563 produced a specific band of 352 bp in the female parent, and a specific band of 384 bp in the male parent. The indoor molecular purity identification were consistent with field purity identification. The primer marker 521 and 563 could be used to distinguish the male parent, female parent and hybrid of ‘Xinshikui 7’, and both of the 2 primer markers can effectively identify the purities of the hybrid seeds of ‘Xinshikui 7’, as well as the authenticity of the seeds. The proposed method was simple, fast, and accurate to operate with the advantages of high reproducibility, and it had become the major method in the identification of sunflower varieties.

Sunflower; Hybrid; Variety purity identification; SSR marker

2016-11-30

2017-04-06

Science and Technology Project of Xinjiang Production and Construction Corps(No. 2016AC024)；National Sunflower Modern Industrial Technology System construction Project(No. CARS-16).

LIU Yantao，male，associate research fellow. Research area:crop cultivation and physiology.E-mail:ziheng1979@126.com

日期：2017-11-17

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.016.html

2016-11-30

2017-04-06

新疆生产建设兵团科技攻关(2016AC024)；国家向日葵现代产业技术体系建设项目(CARS-16)。

柳延涛，男，副研究员，主要从事农作物栽培与生理研究。E-mail：ziheng1979@126.com

王 波，男，副研究员，主要从事农作物栽培与生理研究。E-mail：519392988@qq.com

S565.503.7

A

1004-1389(2017)11-1614-05