下调α-catulin基因表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响*

赵乃阔，胡庆军，史朝晖

（1.河南省焦作市人民医院 消化内科，河南 焦作 454000；2.河南大学淮海医院，河南 开封 475000）

下调α-catulin基因表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响*

赵乃阔1，胡庆军1，史朝晖2

（1.河南省焦作市人民医院 消化内科，河南 焦作 454000；2.河南大学淮海医院，河南 开封 475000）

目的探讨抑制α-catulin基因表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以及可能的机制。方法培养人胃癌细胞SGC-7901，根据转染物不同将细胞分为siRNA-α-catulin组、siRNA-对照序列组和空白对照组，MTT法检测细胞增殖能力，Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力，Western blot检测细胞中α-catulin、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、E-钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达。结果siRNA-α-catulin组细胞24、48、72及96 h时吸光度A值均低于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-α-catulin组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-α-catulin组细胞中α-catulin、N-cadherin及Vimentin蛋白相对表达量均降低，而E-cadherin蛋白相对表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论特异性沉默人胃癌细胞SGC-7901中α-catulin基因表达可有效抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关。

胃癌；α-catulin；细胞增殖；细胞侵袭；上皮-间质转化

R735.2

A

胃癌作为发病率高、致死率高的消化道恶性肿瘤，由于发病隐匿，早期症状不明显且缺乏有效的筛查方法，多数患者临床确诊时已进展至中晚期，错失最佳的治疗时机[1]，即使患者接受手术切除治疗，由于肿瘤复发、转移率高，5年生存率仅20%左右[2]。目前，影响胃癌复发、转移相关机制尚未完全清楚，因此，从分子生物学方面积极探讨相关机制以指导治疗，对延长患者生命，改善预后具有重要意义。αcatulin作为一种细胞骨架连接蛋白，在Rho信号通路中发挥重要作用，与炎症反应、细胞凋亡、骨架重建、细胞迁移与侵袭以及上皮-间质转化等过程密切相关[3]，有研究指出[4]，上皮-间质转化在胃癌细胞转移、侵袭、抗凋亡和耐药中发挥重要作用。本研究拟利用小分子干扰RNA技术（small interference RNA，siRNA）特异性下调人胃癌细胞SGC-7901中α-catulin基因表达，探讨其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，以及可能的机制，以期为胃癌机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

人胃癌细胞SGC-7901（购自美国ATCC），RPMI 1640细胞培养基、优质胎牛血清及胰蛋白酶（购自美国Gibco公司），Lipofectamine 2000转染试剂盒（购自美国 Invitrogen公司），siRNA-α-catulin和siRNA-对照序列（上海吉玛制药技术有限公司设计合成），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、ECL显色试剂盒（购自碧云天生物技术公司），二甲基亚砜（DMSO）（购自北京索莱宝科技公司），Transwell小室（购自美国Corning公司），兔抗人α-catulin多克隆抗体（购自上海万疆生物公司），兔抗人N-钙粘蛋白（N-cadherin）多克隆抗体、鼠抗人E-钙粘蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司），兔抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体（购自美国Cell Signaling公司），实时荧光定量PCR仪（购自ABI公司），凝胶电泳分析系统（购自美国Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组处理 将人胃癌细胞SGC-7901置于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基中，于含5%二氧化碳CO2的37℃恒温培养箱中培养，待细胞融合度达85%时，用胰酶消化后，传代培养，取3～5代细胞进行实验。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书对细胞进行转染，根据转染物不同将细胞分为3组：①siRNA-α-catulin组。转染α-catulin干扰序列：正向5'-CCAUUAACAUCAC CAACAATT-3'，反向 5'-UUGUUGGUGAUGUUAAU GGTT-3'；②siRNA-对照序列组。转染阴性对照序列：正向 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白对照组。不做任何处理。转染后于含5%CO2的37℃恒温培养箱中继续培养，完成后续实验。

1.2.2 不同转染组细胞增殖能力检测 取各转染组细胞，胰酶消化后，调整细胞密度为1.5×106个/ml，接种于96孔板，每孔100μl，于含5%CO2的37℃恒温培养箱中进行培养，分别于培养24、48、72和96 h时，向各孔加入 MTT 液（浓度 5 g/L）20 μl，37℃孵育6 h，去除上清液，再加入200 μl的DMSO，于摇床上振荡15 min，使沉淀溶解充分，利用全自动酶标仪取490 nm波长处对各孔吸光度A值进行检测。

1.2.3 Transwell法检测细胞迁移能力 取各转染组转染后培养48 h细胞，调整细胞密度为1.5×106个/ml，取细胞悬液200μl加入Transwell小室上室，将600 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液加入下室，于37℃恒温培养箱中培养24 h，取出小室，用棉签将上室中散落的细胞轻轻擦去，甲醇固定，结晶紫染色后，用倒置显微镜进行观察，随机选取5个高倍视野计数穿膜细胞数，取均值作为迁移细胞数[5]。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭能力 取Matrigel胶铺于Transwell小室中，风干备用。其余步骤同1.2.3。

1.2.5 Western blot检测各转染组细胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达 取各转染组转染后培养48 h细胞，加入细胞裂解液，用总蛋白提取试剂盒对细胞中总蛋白提取，利用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白纯度并定量。取50μg总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉4℃封闭5 h，用TBST液漂洗3次，加入一抗兔抗人α-catulin多克隆抗体、兔抗人N-cadherin多克隆抗体、鼠抗人E-cadherin多克隆抗体、兔抗人Vimentin单克隆抗体（稀释比例分别为1∶800、1∶500、1∶1 200 及 1∶1 000），4℃过夜孵育，TBST液漂洗3次，加入二抗，室温下孵育4 h，利用ECL显色试剂盒避光反应15min，拍照，利用Image J图像分析软件分析细胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

siRNA-α-catulin组细胞 24、48、72和 96 h时吸光度A值均低于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示siRNA-αcatulin组细胞增殖能力被抑制，见图1。

2.2 各转染组细胞迁移和侵袭能力比较

3组转染组迁移细胞数和侵袭细胞数差异有统计学意义（F=72.505和 99.266，均P=0.000），其中，与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-α-catulin组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1和图 2、3。

2.3 各转染组细胞中 α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较

3 组细胞中 α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量差异有统计学意义（F=33.134、8.486、19.664 和 17.414，均P=0.000），其中，与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-α-catulin组细胞中 α-catulin、N-cadherin及 Vi-mentin蛋白相对表达量均降低，而E-cadherin蛋白相对表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2和图4。

图1 各转染组细胞增殖能力比较

表1 各转染组细胞迁移和侵袭能力比较 （±s）

表1 各转染组细胞迁移和侵袭能力比较 （±s）

注：1）与空白对照组比较，P＜0.05；2）与 siRNA-对照序列组比较，P＜0.05

组别 迁移细胞数 侵袭细胞数siRNA-α-catulin 组 117.6±8.21）2） 85.2±6.71）2）siRNA-对照序列组 179.5±10.7 144.1±10.2空白对照组 182.3±12.0 142.8±9.5 F值 72.505 99.266 P值 0.000 0.000

图2 各转染组细胞迁移能力比较 （结晶紫×400）

图3 各转染组细胞侵袭能力比较 （结晶紫×400）

表2 各转染组细胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较 （±s）

表2 各转染组细胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较 （±s）

注：1）与空白对照组比较，P ＜0.05；2）与 siRNA- 对照序列组比较，P ＜0.05

组别 α-catulin蛋白 N-cadherin蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白siRNA-α-catulin 组 0.26±0.071）2） 0.32±0.081）2） 0.59±0.121）2） 0.43±0.141）2）siRNA-对照序列组 0.73±0.10 0.64±0.13 0.36±0.08 0.79±0.13空白对照组 0.75±0.12 0.63±0.11 0.35±0.10 0.81±0.15 F值 33.134 8.486 19.664 17.414 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图4 各转染组细胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表达

3 讨论

胃癌发病率、致死率均位居我国消化道肿瘤首位，具有发病率高、确诊晚、转移率高及预后较差等特点[6]，研究表明[7]，胃癌复发、转移是导致患者死亡的主要因素。因此，积极探讨影响胃癌侵袭、转移的相关机制对治疗和预后具有重要意义。α-catulin作为Rho信号通路中重要组件，由CTNNAL1基因编码，其蛋白结构中含有与α-连环蛋白（α-actinin）和黏着斑蛋白（Vinculin）结合位点，与炎症、细胞衰老、凋亡及骨架重构等过程密切相关[8]，有研究指出[9]，αcatulin在头颈部鳞癌中呈高表达。CAO等[10]指出，α-actinin与鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭密切相关，可作为癌症患者预后的标志物和未来的治疗靶标。本研究利用siRNA技术特异性沉默人胃癌SGC-7901细胞中α-catulin基因，结果显示，siRNA-α-catulin组细胞中α-catulin蛋白表达量低于siRNA-对照序列组和空白对照组，提示细胞中α-catulin基因表达被成功抑制。

有研究指出[11]，α-catulin可通过改变细胞周期中的关键性基因而抑制肿瘤细胞衰老，加速细胞增殖。本研究MTT细胞增殖结果显示，siRNA-αcatulin组细胞24、48、72和96h时吸光度A值均低于siRNA-对照序列组和空白对照组，说明特异性沉默胃癌细胞中α-catulin基因后，细胞增殖能力被抑制，提示α-catulin可能参与胃癌细胞增殖过程。本研究显示，与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-α-catulin组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，说明特异性沉默胃癌细胞中α-catulin基因可有效抑制细胞迁移、侵袭能力。研究表明[12]，上皮-间质转化与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力密切相关。N-cadherin、E-cadherin和Vimentin是上皮-间质转化特异性标志物，发生上皮-间质转化时，N-cadherin、Vimentin表达升高，而E-cadherin表达被抑制[13]。本研究结果显示，siRNA-α-catulin组细胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表达被抑制，而E-cadherin蛋白表达量增加，说明特异性沉默α-catulin基因上皮-间质转化过程被抑制。

综上所述，特异性沉默人胃癌细胞SGC-7901中α-catulin基因表达可有效抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关。

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（王荣兵 编辑）

Genetic inhibition ofα-catulinon proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells*

Nai-kuo Zhao1,Qing-jun Hu1,Chao-hui Shi2
(1.Department of Gastroenterology,People's Hospital of Jiaozuo City,Jiaozuo,Henan 454000,China;2.Huaihai Hospital Affiliated to Henan University,Kaifeng,Henan 475000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of genetic inhibition ofα-catulinon proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells.MethodsHuman gastric cancer cell line SGC-7901 were cultured and were divided into siRNA-α-catulin group,siRNA sequence control group and negative control group.MTT and Trans well assay were performed to measure cell proliferation and cell invasion,respectively.The levels of α-catulin,N-cad herin,E-cad herin and Vimentin were determined by Western blot.ResultsMTT results indicated that optical density value at 24 h,48 h,72 h and 96 h in the siRNA-α-catulin group were significantly lower than that of siRNA-control sequence group and negative control group (P＜0.05).The amount of migrating cells and invasive cells in siRNA-α-catulin group were decreased dramatically compared with siRNA-control sequence group and blank control group (P＜ 0.05).Expression levels of α-catulin,N-cadherin and Vimentin in siRNA-α-catulin group decreased while E-cadherin increased significantly when compared with siRNA-control sequence group and blank control group (P＜0.05).Conclusion Genetic knockdown ofα-catulingene in SGC-7901 cell line could prevent cell proliferation,migration and invasion by inhibition of transition of epithelial-mesenchymal.

gastric cancer;α-catulin;cell proliferation;cell invasion;epithelial-mesenchymal transit

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.006

1005-8982（2017）27-0027-05

2017-05-16

河南省2015年科技发展计划（No：152300410164）