急性单核细胞白血病全基因组微小RNA的表达谱分析*

林小聪 ，李宁 ，符伟玉 ，兰柳波 ，张海涛 ，张宇明

（1.广东医科大学 生物化学与分子生物学研究所，广东 湛江 524023；2.广东医科大学附属医院 血液科，广东 湛江 524001）

急性单核细胞白血病全基因组微小RNA的表达谱分析*

林小聪1，李宁2，符伟玉1，兰柳波1，张海涛1，张宇明2

（1.广东医科大学 生物化学与分子生物学研究所，广东 湛江 524023；2.广东医科大学附属医院 血液科，广东 湛江 524001）

目的研究急性单核细胞白血病（AMoL）全基因组的微小RNA（miRNA）表达谱。方法应用Illumina高通量测序技术对10例AMoL患者和10例非恶性血液病患者骨髓样本的miRNA表达水平进行检测，分析两者的表达差异，并通过茎环引物实时荧光定量 PCR（Stem-loop qPCR）技术对部分Illumina测序结果进行验证。结果两组样本共发现差异表达的miRNA 285个，其中，199个miRNA在AMoL组呈表达上调，86个miRNA呈表达下调。6个miRNA的Stem-loop qPCR验证结果与其测序结果具有相同的变化趋势。结论miR-126-3p和miR-29b-3p可作为潜在的分子靶点用于AMoL发病机制的进一步研究。

急性单核细胞白血病；微小RNA；测序

急性单核细胞白血病（acutemonocytic leukemia，AMoL）为急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）最常见的亚型之一；其病例数约占AML 20%～30%，在各种AML亚型中居第2位[1]。相比于其他的AML亚型，AMoL高白细胞血症、髓外浸润以及不良染色体核型的发生率更高，常规化疗完全缓解率低、容易复发及预后不佳[1-2]。目前，AMoL的发病机制仍未完全明确，可能与电离辐射、染色体异常及基因突变等多种因素有关[3]。为寻找新的治疗靶点，迫切需要对AMoL的发病机制进行进一步研究。微小 RNA（micro ribonucleic acid，miRNA）是一类内源性、具有基因表达调控功能的小分子单链非编码RNA，长度约为 18～25 个核苷酸（nt）[4]。研究表明，miRNA与白血病发生、发展密切相关，可能成为白血病潜在的治疗靶点[5]。为阐明AMoL的miRNA表达谱，本研究应用Illumina高通量测序技术对AMoL与对照组骨髓样本的miRNA表达水平进行对比分析，为研究AMoL相关发病机制和寻找新型的分子靶点提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集来自于广东医科大学附属医院血液科10例AMoL患者（男性6例，女性4例；年龄14～64岁，平均41.2岁）和10例非恶性血液病对照者（骨髓象正常的贫血或发热查因患者，男性6例，女性4例；年龄10～73岁，平均39.0岁）的骨髓样本。所有AMoL患者均为初发病例，在采样前均未接受放疗或化疗，且符合AMoL的诊断标准。本研究已获得广东医科大学附属医院伦理学委员会审核批准，并取得所有患者的知情同意。

1.2 主要试剂

无RNase的DnaseⅠ（购自美国Promega公司），Trizol试剂（购自美国Invitrogen公司），Small RNA测序接头、TruSeq Rapid SR cluster试剂盒以及Tru Seq Rapid SBS试剂盒（美国Illumina公司产品），SuperscriptTMⅢ逆转录酶（购自美国Invitrogen公司），2×SYBR Green PCR混合液（美国 Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 总RNA样品的提取 根据Trizol试剂说明书抽提组织总RNA，以无RNase的DnaseⅠ消化以去除基因组DNA污染。20例RNA样品分别以AMoL组和对照组为组单位等质量混合，在230、260及280 nm波长以Nano Drop ND-1000型分光光度计测定其吸光度（A）值，计算RNA样品的浓度并分析其纯度，通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。

1.3.2 Small RNAs文库构建和Illumina测序RNA样品在T4RNA连接酶的催化下加上3’、5’small RNA测序接头，所得产物经逆转录PCR扩增及聚丙烯胺凝胶电泳纯化生成Small RNAs文库。以Agilent 2100型生物分析仪对Small RNAs文库进行定量分析。应用Illumina cBot簇生成系统，按照TruSeq Rapid SR cluster试剂盒说明书，对文库进行克隆扩增；然后根据TruSeq Rapid SBS试剂盒说明书，在Illumina HiSeq 2000测序系统上行高通量深度测序。

1.3.3 测序数据的处理和注释 以Off-Line Basecaller软件对高通量测序所生成的原始图像进行分析，读取碱基序列信息并转换为相应的数据。然后，经去接头、去冗余、去低质量以及去污染等处理，获得16～30 nt长度的高质量干净序列并进行序列长度分布分析。将干净序列分别与RefSeq数据库、Rfam数据库以及RepBase数据库进行序列比对和分类注释，去除mRNA、重复序列、tRNA、rRNA、snRNA以及sRNA等序列；余下序列再与miRBase数据库中已知的人类pre-miRNA进行序列比对和注释，获取两样本miRNA的表达丰度和染色体分布等信息。

1.3.4 miRNA的差异表达分析 首先对两样本miRNA的表达丰度进行标准化处理 [公式：miRNA的标准化表达丰度（normalization of the calculation of transcript parts per million，TPM）=miRNA 的表达丰度/样本miRNA的总表达丰度×106]，然后再计算两样本的miRNA差异表达比值 [公式：miRNA的差异表达比值=（AMoL组miRNA标准化表达丰度值+10TPM）/（对照组miRNA标准化表达丰度值+10TPM）]。如果差异表达比值≤0.5或≥2.0，则为差异有统计学意义；如果0.5＜比值＜2.0则为差异无统计学意义。

1.3.5 茎环引物实时荧光定量PCR（stem-loop primer-based quantitative real-time polymerase chain reaction，Stem-loop，qRT-PCR）利用 miRNA 的茎环（Stem-loop）逆转录引物，根据SuperscriptTMⅢ反转录酶说明书进行逆转录反应。应用ABI公司Prism7500型qRT-PCR仪，参照2×SYBR Green PCR混合液说明书，以U6 snRNA作为内参照进行qRT-PCR。反应参数为：95℃预反应10 min，使模板完全解链。然后95℃变性10s，60℃退火及延伸60s，重复40个循环。检测结果计算采用常规的2-△△Ct法。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表达，比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA的质量分析

提取的组织RNA样品分别以AMoL组和对照组为组单位等量混合后，对其进行纯度分析（见表1）和RNA完整性分析（见图1）。结果表明，其A260/A280比值都在1.8～2.0，且A260/A230比值都＞1.8，提示样本RNA的纯度较高、质量良好。电泳结果显示两组总RNA均可见18和28 S 2条清晰的条带，而5 S的条带则比较模糊（见图1）；提示RNA的完整性好。上述结果表明，总RNA的质量符合实验要求，可用于后续Small RNAs文库的构建。

2.2 Small RNAs文库的质量评估

以Agilent 2100型生物分析仪对Small RNAs文库进行质量分析（见表2）。结果表明，两样本Small RNAs文库的片段长度峰值均在130～155 nt且其摩尔数＞1 fmol，提示Small RNAs文库的质量良好，可用于后续的克隆扩增和测序分析。

2.3 Small RNA干净序列的长度分布和分类注释

Small RNA干净序列（16～30 nt）的长度分布分析表明，对照组及AMoL组的干净序列均大致呈正态分布在22 nt序列两侧（见图2）。其中，符合miRNA片段长度（18～25 nt）的干净序列所占的比例最高，其在对照组与AMoL组分别占93.70%和82.31%。干净序列的序列比对和分类注释表明，miRNA在对照组（占80.05%）及AMoL组（占54.44%）所占的比例最高，两者均＞50%（见图3）。上述数据初步验证Illumina测序结果的有效性。

表1 总RNA的纯度分析

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图

表2 Small RNAs文库的定量分析

2.4 miRNA的差异表达谱分析

两组样本发现差异表达的miRNA 285个。其中，199个miRNA在 AMoL组呈表达上调，86个miRNA呈表达下调。hsa-miR-122-5p在AMoL组表达上调最显著，而hsa-miR-941则表达下调最明显。见表3。

图2 Small RNA干净序列的长度分布

图3 匹配的干净序列的分类注释

表3 前10个表达上调和下调miRNA的差异

2.5 Stem-loop qRT-PCR验证结果

为验证Illumina测序结果的可靠性，笔者选择2个表达上调（miRNA-155-5p和miRNA-221-3p）、2个表达下调（miRNA-106b-5p和miRNA-142-3p）以及2个表达差异无统计学意义miRNA（miRNA-532-5p和miRNA-423-5p）进行Stem-loop qRT-PCR验证。结果表明，上述6个miRNA在两组样本中的变化趋势与Illumina测序结果一致（见表4），说明Illumina测序结果可靠、有效。

表4 Illumina测序结果的Stem-loop qRT-PCR验证

3 讨论

作为一种具有基因表达调控功能的内源性小片段单链RNA，miRNA与白血病关系密切。研究表明，＞60%的miRNA基因存在于白血病相关的染色体易位区，多种miRNA可通过调节细胞增殖、分化及凋亡与耐药等相关基因的表达在白血病发生、发展过程中发挥关键作用，可能成为白血病潜在的诊断标志物和分子靶点[6-7]。但目前尚无通过Illumina高通量测序技术在AMoL患者临床样本中系统性研究miRNA表达谱的报道。本结果表明，两者的miRNA表达谱存在较大的差异，两组样本共鉴定差异表达的miRNA 285个，其中，199个miRNA在AMoL组呈表达上调，86个miRNA呈表达下调。笔者随后选取6个miRNA，应用Stem-loop qRT-PCR技术证实Illumina测序结果的可靠性。

miRNA-29b-3p是一种基因定位于染色体7q32和1q32的miRNA分子，在胃癌、前列腺癌及肺癌等多种实体瘤以及AML中呈低表达；在AML中，染色体7q缺失或CEBPA基因功能障碍可导致miRNA-29b-3p 表达下调[8]。GONG 等[9]报道，miRNA-29b-3p可通过作用于其靶基因CCND2和AKT2，抑制AMoL细胞系THP1增殖并诱导细胞凋亡。本研究表明，miRNA-29b-3p在AMoL患者骨髓样本中表达呈下调，与文献报道基本相符，提示miRNA-29b-3p在AMoL发病机制中可能起一定的作用。相比于其他的AML亚型，miRNA-199b-5p在AMoL临床样本中呈异常低表达，并与AMoL患者预后呈正相关；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂AR-42和Panobinostat可通过上调hsa-miRNA-199b-5p表达诱导THP-1细胞凋亡[10]。笔者研究发现，miRNA-199b-5p在AMoL样本中也呈低表达，与文献报道一致，提示miRNA-199b-5p可能与AMoL发病机制相关。

miRNA-126基因在染色体上定位于9q34.3，其转录产物为miRNA-126-5p和miRNA-126-3p。研究表明，miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AML中均呈高表达并与患者预后呈负相关[11]。LEEUW等[12]发现，沉默miRNA-126-3p表达可抑制THP1细胞增殖、诱导细胞凋亡并抑制NOD/SCID小鼠移植瘤的生长。提示miRNA-126-3p在AMoL中可能具有潜在的癌基因活性。本组miRNA-126基因的转录产物miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AMoL中均呈表达上调，与文献报道基本相符。HO等[13]报道，miRNA-135b-5p在依托泊甙以及替尼泊苷耐药的白血病细胞中呈表达上调，其过表达可诱导白血病细胞对依托泊甙以及替尼泊苷产生耐药性。此外，miRNA-135b-5p在AMoL细胞系U937以及THP-1中过表达均可下调Ppm1e并激活AMPK[14]。研究表明，AMPK激活在AMoL细胞凋亡过程中起重要作用；骨髓脂肪细胞β-氧化所介导AMPK的激活可抑制AMoL细胞凋亡并促进细胞增殖[15]。本组miRNA-135b-5p在AMoL样本中也呈高表达，与文献报道基本相符，提示miRNA-135b-5p在AMoL细胞凋亡过程中可能起一定的抑制作用，具有潜在的研究价值。

综上所述，AMoL患者与非恶性血液病对照者骨髓样本的miRNA表达谱存在较大的差异。根据其差异表达趋势与文献报道的符合程度，笔者得到5个与AMoL发病机制有密切关系的miRNA（包括miRNA-29b-3p、miRNA-199b-5p、miRNA-126-3p、miRNA-126-5p 及 miRNA-135b-5p）。其中，miRNA-126-3p的差异表达比值最大，呈明显的表达上调；而miRNA-29b-3p的差异表达比值最小，呈明显的表达下调；再加上已有文献证实两者在AMoL细胞增殖和凋亡过程中具有重要作用。因此，miRNA-126-3p和miRNA-29b-3p可作为潜在的分子靶点用于AMoL发病机制的进一步研究。

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（王荣兵 编辑）

Whole-genome analysis profile of MicroRNA in acute monocytic leukemia*

Xiao-cong Lin1,Ning Li2,Wei-yu Fu1,Liu-bo Lan1,Hai-tao Zhang1,Yu-ming Zhang2
(1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524023,China;2.Department of Hematology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524001,China)

ObjectiveTo investigate the whole-genome MicroRNA (miRNA)profile in acute monocytic leukemia (AMoL).MethodsIllumina high-throughput sequencing technology was utilized to screen differentially expressed miRNA in bone marrow samples of 10 AMoL patients as well as 10 patients with non-malignant hematologic diseases.Stem-loop primer-based real-time quantitative polymerase chain reaction(Stem-loop qPCR)was carried out to validate the sequencing data.ResultsIn total of 285 differentially expressed miRNAs,199 up-regulated and 86 down-regulated miRNAs were identified in AMoL patients compared with the control group.Further stem-loop qPCR results confirmed similar expression of 6 miRNAs identified by sequencing.ConclusionsMiR-126-3p and miR-29b-3p can be potential targets for further study of AMoL.

acute monocytic leukemia;micro ribonucleic acid;sequencing

R394.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.007

1005-8982（2017）27-0032-05

2017-05-21

广东省自然科学基金（No：2016A030313677）；广东省医学科学技术研究基金（No：A2016193）

张宇明，E-mail：13670982222@163.com