乌司他丁干预水下爆炸致兔急性肺损伤NF-κB、MMP-9的表达变化

李雪萍，齐晓林*，叶长青，王前进，邵先安*，马宏昊

(1.蚌埠医学院附属解放军第123医院 检验科，安徽 蚌埠233015； 2.中国科技大学 近代力学系爆炸实验室，安徽 合肥230027)

乌司他丁干预水下爆炸致兔急性肺损伤NF-κB、MMP-9的表达变化

李雪萍1，齐晓林1*，叶长青1，王前进1，邵先安1*，马宏昊2

(1.蚌埠医学院附属解放军第123医院 检验科，安徽 蚌埠233015； 2.中国科技大学 近代力学系爆炸实验室，安徽 合肥230027)

目的探讨乌司他丁干预对水下爆炸致兔急性肺损伤血清核转录因子(Nuclear factor kappa B,NF-κB)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达影响。方法以水下爆炸装置复制兔急性肺损伤模型，检测爆炸后4、12和24 h血清NF-κB、MMP-9变化。结果爆炸后4 h乌司他丁组NF-κB的表达(818.60±222.48 ng/L)和损伤组(1052.40±243.87 ng/L)相比降低(t=2.240,P=0.038)；爆炸后12 h乌司他丁组(730.10±153.34 ng/L)和损伤组(1000.90±407.87 ng/L)相比未见显著变化(t=1.965,P=0.065)；但在爆炸后24 h乌司他丁组(656.70±214.02 ng/L)和损伤组(1035.30±362.00 ng/L)相比表达量又显著降低(t=2.847,P=0.011)。MMP-9在爆炸后4 h、12 h乌司他丁组损伤组未见显著差异；但爆炸后24 h乌司他丁组(28.40±8.30 μg/L)血清MMP-9表达显著低于损伤组(42.10±15.24 μg/L)(t=2.497,P=0.022)。结论乌司他丁干预下实验兔在爆炸后24 h血清NF-κB、MMP-9明显降低。

乌司他丁；水下爆炸；急性肺损伤；NF-κB；MMP-9

(ChinJLabDiagn,2017,21:2000)

一般认为，空气中爆炸致实验动物胸部、腹部或脊髓等损伤较多[1]，而水下冲击伤是岛礁作战和渡海登陆作战中常见的一种损伤，尤其以肺部损伤最为严重,是伤者死亡的主要原因之一[2]。目前对水下爆炸冲击波致实验动物肺损伤及救治的研究甚少。有文献提示空气爆炸伤引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI) 是由多种炎性递质及效应细胞共同参与，并呈级联放大的瀑布样炎症与继发性弥漫性肺实质损伤。在参与炎症反应与肺损伤中的众多炎症递质中， NF-κB是与创伤相关的核转录因子之一，是多种信号转导途径的汇聚点[3]。该因子参与巨噬细胞和白细胞活化，控制着许多促炎因子的表达[4]，在严重创伤所致多器官功能损害的发生发展中起关键性的作用[5]。基质金属蛋白酶9(matrix metal proteinases-9,MMP-9)是金属蛋白酶家族中最重要的一类，在肺损伤过程中具有增强炎症因子效应，加大肺组织损伤[6]的作用。乌司他丁是从人尿液中分离纯化的一种广谱胰蛋白酶抑制剂，可抑制炎症因子的释放，阻止急性肺损伤的发生发展，有效缓解急性炎症引起的肺损害[7]。因此，我们对急性肺损伤兔给予乌司他丁治疗，通过监测血清NF-κB 和MMP-9变化探讨乌司他丁在水下爆炸致兔急性肺损伤时对NF-κB 和MMP-9表达的影响，从而为肺损伤的致病机制和临床救治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂DNM-9602 酶标分析仪(北京普朗)；乌司他丁( 广东天普生化医药股份有限公司，批号031505264)；兔MMP-9 ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司，批号201602)；兔NF-κB ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司，批号201602)

1.2实验动物及方法健康成年新西兰兔20只(安徽长临河医药科技有限公司，许可证号syxk(皖)2007-002)，体重1.8±0.2 kg。动物实验前适应性喂养3天，自由饮食饮水，观察一般情况及生命体征无异常即可用于实验。将动物随机分为爆炸损伤组(10只)和乌司他丁治疗组(用量2.5万单位/kg体重，10只)。实验前动物禁食6 h，按照氯胺酮40 mg/kg,氟哌利多1.6 mg/kg肌肉注射，麻醉时间3-5 min[8-9]。麻醉后，仰卧位固定在动物台上，颈前部和胸部去毛，尽量完全暴露胸部，分别经左颈总动脉和右颈外静脉向心方向放置留置针，并将留置针的体外部分绕颈固定，以防脱落。爆炸试验前将动物上肢再固定，防止滑落，按有关文献和预试验结果设定爆炸剂量、距离[10]。爆炸后立即解绑家兔，注意保暖，清理呼吸道，使其右侧卧位，立即记录呼吸、精神状态、应激反应等情况。乌司他丁治疗组实验兔在爆炸后即刻通过静脉置管给予药物，爆炸损伤组实验兔给予同等剂量生理盐水。在爆炸后4 h、12 h、24 h分别用5 ml注射器经颈总动脉置管抽取5 ml的动脉血，缓慢注入红色干管内并进行标记。由于兔的血液呈高凝状态，为防止血栓形成，每次抽取动脉血样后及时给予肝素封管[11]。将分离好的血清放入-40℃冰箱内冻存备用。采用ELISA方法检测MMP-9、NF-κB含量，实验严格按照说明书进行。

1.3统计学分析数据采用SPSS17.0 统计软件处理，Plt;0.05视为有统计学意义。

2 结果

为探讨炎性因子NF-κB和MMP-9在爆炸性肺损伤中的可能作用，我们采用ELISA 方法对损伤组和乌司他丁组兔血清细胞因子浓度进行了检测，结果显示乌司他丁组与损伤组相比血清NF-κB浓度在爆炸后4 h(t=2.240,P=0.038)、24 h均(t=2.847,P=0.011)明显降低，而12 h(t=1.965,P=0.065)则未见显著改变(表1)。血清MMP-9在爆炸后4、12 h未见显著改变，但24 h时乌司他丁治疗组血清MMP-9则降低(t=2.497,P=0.022)(表1)，提示乌司他丁干预治疗后炎性因子NF-κB和MMP-9的降低可能有利于机体发挥保护作用，减少炎症损伤，在爆炸性肺损伤中扮演着重要作用。

表1 各组在不同时间点血NF-κB(ng/L)和MMP-9(μg/L)浓度的比较

3 讨论

水下爆炸伤要比空气爆炸伤死亡率高得多，而肺是体内比较脆弱、柔软且含气的组织,最易受到冲击，是主要的受损靶器官[12]。在肺损伤的过程中，多种炎症因子参与其中，在治疗上，有效控制肺部过度炎症反应是治疗ALI的关键[13]。乌司他丁能够抑制氧自由基产生，抑制白细胞过度激活、保护血管内皮和基膜、抑制血管通透性增加，是常用的急性炎症反应治疗药物[14]。我们通过复制水下爆炸致兔急性肺损伤，并在爆炸即刻给予乌司他丁治疗。结果显示乌司他丁干预24 h内NF-κB和MMP-9浓度显著下降，表明乌司他丁在急性炎症早期使用能够明显抑制NF-κB和MMP-9的释放。NF-κB是与创伤相关的核转录因子之一，在创伤后的急性炎症反应过程中具有多种功能[3-5]。我们的实验结果提示在炎症发生时就使用乌司他丁可能会减少血清NF-κB和MMP-9的释放，有助于创伤性炎症的好转，与有关研究相类似[15]。在肺损伤过程中MMP-9 是参与降解破坏细胞外基质中的最主要组成成分，且能增强放大炎症因子效应，使中性粒细胞在肺局部浸润，刺激肺组织局部的实质细胞释放出更多的MMPs。另外，MMP-9还可以刺激肺组织局部的实质细胞如肺成纤维细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞等释放出更多的MMPs，放大对肺组织的损伤[6]。有学者通过降低MMP-9含量改善心肌纤维化程度[16]，而我们实验中早期应用乌司他丁治疗降低了MMP-9的表达，可能有助于肺损伤的治疗。

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InvestigationofNF-κBandMMP-9inseraofrabbitswithacutelunginjuryinterposedbyUlinastatininunderwaterexplosion

LIXue-ping1,QIXiao-lin1*,YEChang-qing1,etal.

(1.TheDepartmentofClinicalLaboratoryoftheAffiliated123rdHospitalofPLAofBengbuMedicalCollege,Bengbu233015,China;2.LabofExplosionMechanicsofDepartmentofModernMechanicsintheUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230027,China)

ObjectiveThe aim of this research was to elucidate the change of NF-κB and MMP-9 in the rabbits with acute lung injury interposed by Ulinastatin enduring underwater explosion.MethodsUnderwater explosion decive was applied to cause acute lung injury in rabbits.The NF-κB and MMP-9 concentration was detected by ELISA methods at 0,4,12 and 24 hour after explosion,respectively.ResultsThe expression of NF-κB in sera of rabbits in ulinastain group (818.60±222.48 ng/L) were significant lower than that of in injury group (1052.40±243.87 ng/L) (t=2.240,P=0.038) at 4 hours after burst.Meanwhile,at 12 hours after burst,there were no significant difference between ulinastain group (730.10±153.34 ng/L) and the injury group(1000.90±407.87 ng/L)(t=1.965,P=0.065).Nevertheless,the expression of NF-κB in the sera of rabbits in ulinastatin group (656.70±214.02 ng/L ) were lower than that of in injury group(1035.30±362.00 ng/L)(t=2.847,P=0.011) at 24 hour after burst.On the other hand,there was no significant difference in the expression of MMP-9 in sera of rabbits between the ulinastain and injury group at 4 hours and 12 hours after burst.Nevertheless,the MMP-9 concentration in rabbits sera in the ulinastatin group (28.40±8.30 μg/L) were lower than that of in injury group (42.10±15.24 μg/L)(t=2.497,P=0.022).ConclusionThe NF-κB and MMP-9 expression in sera of the rabbits in ulinastatin group were dramatically decreased than that of in injury group at 24 hours after burst.

Ulinastatin;underwater explosion;acute lung injury;NF-κB;MMP-9

南京军区医学重点课题资助项目(14ZD20)

*通讯作者

1007-4287(2017)11-2000-03

R561

A

李雪萍(1991-)，女，在读研究生，主要从事分子免疫研究。

2016-11-17)