甲酸钠诱导视网膜光感受器细胞自噬

金艳玲，王 英，陈 悦，许文晶，胡 萍，徐韶琳

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

甲酸钠诱导视网膜光感受器细胞自噬

金艳玲，王 英，陈 悦，许文晶，胡 萍，徐韶琳*

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

目的近些年来，发生过很多因饮用假酒致甲醇中毒的事件。本研究旨在探讨甲酸钠诱导视网膜光感受器细胞 (661W细胞) 损伤过程中对细胞自噬水平的影响。方法将15和30 mM浓度的甲酸钠分别加入661W细胞培养基作用24 h 后，用MDC荧光染色来检测细胞自噬水平改变，透射电镜观察661W细胞自噬体的形成， Western blotting 法检测LC3、 p-mTOR 、Beclin 1 及JNK、p-JNK蛋白的表达，流式细胞仪分析检测细胞内活性氧的变化。结果与对照组比较，15或30 mM甲酸钠处理661W细胞后，荧光显微镜下观察到细胞自噬水平增强，透射电镜下观察到自噬体形成，Western blotting 法显示LC3-II ，Beclin 1以及pJNK的蛋白表达水平上调，而p-mTOR 的蛋白表达水平减少，流式细胞仪检测法显示甲酸钠处理的661W细胞内活性氧水平增加。结论甲酸钠可诱导661W细胞自噬，而自噬可能参与假酒中毒所致的视觉损伤过程。

甲醇中毒；甲酸钠；自噬；661W细胞；活性氧

(ChinJLabDiagn,2017,21:1995)

背景 近些年来，发生过很多因饮用假酒致甲醇中毒的事件。甲醇是一种挥发性液体,易溶于水和体液中,虽然甲醇本身不是一种毒素，但其代谢物有毒，可能引起视力损害、大脑及心血管损伤甚至死亡[1，2]。

甲醇可在脱氢酶的作用下先后转化为甲醛和甲酸,二者的毒性作用远大于甲醇的毒性作用，可诱导细胞线粒体功能障碍，抑制细胞色素氧化酶活性，抑制视网膜氧化磷酸化的过程,影响ATP的合成，从而引起细胞退行性病变，甚至导致细胞死亡[3]。而大脑和视网膜作为高代谢器官极易因ATP的减少受到影响。

自噬( autophagy)是细胞自身的一种分解代谢过程，被认为是除了凋亡和坏死以外的第三种细胞死亡模式[4]。自噬表现为细胞降解多余或衰亡的细胞器及损伤蛋白的现象，生命体以此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳态，细胞内过度自噬或自噬不足都会引起细胞损伤，并与某些疾病的发生相关[5,6]。

本研究旨在研究甲酸钠暴露于661W细胞对细胞自噬水平的影响，进一步探讨甲醇中毒所致的细胞自噬性死亡的分子机制。为研究甲醇中毒引起视觉损伤的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1抗体和反应物

cJun Nterminal kinase(JNK)， (p)JNK， LC3，Beclin-1和mTOR的抗体购买于美国Cell Signaling Technology公司。GAPDH购买于上海康晨生物技术公司。所有主要的抗体稀释1∶1,000。山羊第二抗体由英国Thermo Fisher Scientific公司制得，超敏化学发光试剂盒(ECLPlus kit)购买于上海碧云天公司。甲酸钠购置于上海化学试剂国药控股有限公司。MDC， DCFHDA，购自美国SigmaAldrich公司。

1.2细胞培养

661W细胞(ATCC细胞库)培养于含有10%的胎牛血清，100 g/ml的链霉素， 100 u/ml的青霉素培养液。置于37℃、含有95%的空气及5%的CO2的饱和湿度的培养箱中培养。细胞融合达到80%进行传代。每3-4 d应用胰蛋白酶消化传代1次。

1.3MDC染色

MDC可使自噬小体染色显像。用不同浓度的甲酸钠(15或30 mM) 常规处理661W细胞6 h。再用0.1 mM浓度的 MDC孵化30 min。用荧光显微镜下观察荧光图像。

1.4透射电镜观察超微结构

用两种不同浓度的甲酸钠(15或30 mM) 常规处理661W细胞24 h，收集细胞、离心，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，离心、弃缓冲液，然后加入预冷的1% 饿酸固定，重悬，置于4℃冰箱固定4-6小时后送样观察。

1.5Westernblotting检测蛋白

在常规培养24 h后的661W细胞培养基中加入不同浓度(0，15，30 mM)的甲酸钠，孵育24 h。收集细胞于3 000 r/min离心5 min，加入裂解液于冰上裂解30-45 min，细胞溶解产物于4℃、12 000 r/min离心5 min。在上清液中加入1/4容积的4×SDS样本液后煮沸5 min。SDSPAGE电泳后转膜至聚二氟乙烯膜上，用含有5%的脱脂牛奶室温封闭1 h。加入稀释的一抗(1∶1000)，于4℃过夜孵育。用TBST洗涤膜3次后，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育30 min。充分洗涤后，用ECL液化学发光方法检测蛋白。

1.6活性氧(ROS)检测

细胞内活性氧(ROS)能够氧化荧光探针DCFH-DA，产生荧光产品—2′,7′ -二氯荧光素(DCF)[7]。用浓度为0、15、和30 mM的甲酸钠处理细胞24 h,去掉上清液,用PBS洗涤三次。收集细胞，离心，加入DCFH - DA(10 μM最终浓度)并充分混匀，在37℃下孵化15 min。最后,用流式细胞仪进行检测。

1.7统计学处理

数据分析采用SPSS 23.0统计学软件，通过对两组间的t检验或多组间的方差分析检测差异。数据用标准差表示。Plt;0.05表明统计学上有显著差异。

2 结果

2.1MDC荧光染色观察细胞自噬

MDC可特异性地结合于细胞自噬囊泡内，荧光显微镜下呈现为绿色荧光颗粒，荧光强度与自噬囊泡数量成正相关，因此，可根据荧光显微镜下，细胞内荧光颗粒的增加来评估细胞自噬的发生。如图1所示，与对照组相比，经过甲酸钠处理的661W细胞，在经MDC染色后，胞浆内出现了明显的绿色荧光颗粒,30 mM甲酸钠处理组较15 mM甲酸钠处理组绿色荧光颗粒增多，说明甲酸钠能够诱导细胞自噬的发生。

2.2透射电镜观察661细胞自噬体的形成

如图2，与对照组相比甲酸钠处理的661W细胞内自噬体形成，并且30 mM甲酸钠处理组较15 mM甲酸钠处理组自噬体形成较多。透射电镜下观察到，实验组细胞内见膜状结构包绕损伤细胞器或细胞溶质形成的液泡状结构-自噬体。结果表明，甲酸钠作用的661W细胞自噬水平增加。

2.3甲酸钠作用于661W细胞后LC3II、Beclin-1、p-mTOR水平的变化

为了探讨甲酸钠是否诱导661W细胞自噬，Western blotting法检测LC3、Beclin 1、p-mTOR的蛋白表达水平。与对照组相比，用15和30 mM浓度甲酸钠处理的661W细胞LC3 - II及Beclin-1的蛋白表达水平显著增加， p-mTOR表达水平下降(图3)。在这一实验中LC3I- I表达水平无显著变化。这些结果表明,细胞自噬水平的增加，可能与甲酸钠诱导661W细胞毒性作用相关。

图1荧光显微镜观察MDC染色后细胞内自噬囊泡分布情况浓度为0(对照组),15和30mM甲酸钠作用于661W细胞，经MDC染色于荧光显微镜观察。与对照组比较，15和30mM甲酸钠作用的661W细胞产生绿色荧光颗粒增多。MDC荧光颗粒由箭头表示。

图2透射电镜下观察自噬体的形成661W细胞暴露在浓度为0(对照组),15和30mM甲酸钠中培养，送样观察。与对照组相比，暴露在15和30mM甲酸钠的661W细胞形成多个典型的膜结构包绕损伤细胞器或细胞溶质形成的液泡状结构-自噬体。(如箭头所示)

2.4甲酸钠可使细胞内活性氧ROS水平增加

用DCFH - DA染色检测细胞内活性氧的生成。DCFH-DA容易经细胞膜扩散,并被酯酶脱去乙酰基，变成非荧光作用的DCFH 。在活性氧的作用下，DCFH迅速被氧化成高荧光产品，DCF。因此，DCF的荧光强度与细胞内活性氧的数量成正相关。如图4A所示，用15和30 mM浓度甲酸钠处理的661W细胞，荧光强度增加。图4B所示，细胞经15和30 mM甲酸钠处理24 h，细胞内活性氧水平有所增加。Plt;0.05，有统计学差异。这些结果表明，细胞内活性氧水平的增加可能参与甲酸钠-诱导661W细胞毒性损伤过程。

图3 western blotting法检测LC3、Beclin 1、p-mTor的蛋白表达水平

图4流式细胞仪分析检测甲酸钠处理的661W细胞内活性氧的生成用DCFH-DA染色检测分析甲酸钠(15和30mM)处理的661W细胞，并与对照组相比较。(A)观察荧光强度信号得知，甲酸钠处理的661W细胞荧光强度增加。(B)用甲酸钠(15和30mM)处理和对照组661W细胞的DCF荧光强度。(*Plt;0.05;**Plt;0.01)。

2.5甲酸钠可使细胞内的JNK通路被激活

本实验中，用不同浓度(0，15和30 mM)的甲酸钠处理661W细胞，western blotting法检测JNK 和 pJNK蛋白表达。如图5所示,甲酸钠处理661W细胞后，其pJNK蛋白表达水平增加,JNK蛋白质表达水平没有显著变化。这些结果表明,当用甲酸钠处理661W细胞可是细胞JNK信号通路被激活。

图5westernblotting法检测JNK和pJNK蛋白表达661W细胞暴露在浓度为0(对照组),15或30mM甲酸钠中培养。

3 讨论

甲醇对视神经及视网膜有选择性毒性作用，致使视网膜坏死和视神经脱髓鞘病变。急性甲醇中毒主要眼部的损害由轻到重常表现为：视物模糊、眼痛、眼前黑影、闪光感、复视,以及视力下降、视野损害甚至视力丧失、对光反射消失等[8,9]。

活性氧类(reactive oxygen species,ROS)是一系列含氧的活性物质,对调节细胞程序和信号转导起着至关重要的作用[10]。如果活性氧在胞内蓄积，可能引发氧化应激，致使细胞成分损伤，有研究证实，活性氧可以作为一种信号分子，参与细胞自噬性死亡的过程[11,12]。

众所周知,线粒体呼吸链电子传递的失调,或抗氧化酶的功能障碍,都可能导致活性氧的积累[13]。此外,活性氧与JNK信号通路的高生物活性和功能的第二信使相关。JNK作为有丝分裂原激活蛋白激酶家族中的一员,参与多种细胞通路的信号传递,包括细胞凋亡、细胞自噬、炎症和致癌作用[14]。在本研究中,当甲酸钠作用661W后，JNK信号通路被激活，活性氧水平增加。ROS是JNK通路强有力的催化剂，可以氧化失活内源性JNK抑制剂,这些抑制剂包括JNK磷酸酯酶、谷胱甘肽S -转移酶[15]。JNK通路的激活可诱导ROS积累,ROS以正反馈的方式激活JNK。本研究表明，甲酸钠使细胞内ROS增多，JNK 和 pJNK蛋白表达水平增加，pJNK蛋白增加更为明显，JNK信号通路激活，而这种激活可能促进甲酸钠作用的661W细胞发生自噬。

自噬是一种负责蛋白质和细胞器清除的细胞通路,因此一定程度的自噬可以维持正常的细胞稳态，但过度的自噬活动会促进细胞死亡[16]。本研究中,甲酸钠作用的661W细胞中观察到自噬体形成，LC3II、Beclin-1蛋白表达水平的增加，p-mTOR水平下降。透射电镜可观察到典型的自噬超微结构，被认为是证明细胞自噬的金标准[17]。本研究中，透射电镜下，观察到甲酸钠暴露的661W细胞自噬体形成，如图2所示，可见膜状结构包绕损伤细胞器或细胞溶质形成的液泡状结构-自噬体。Beclin-1 和LC-3 作为自噬相关蛋白，可在一定程度上反映自噬表达与其强烈的程度，是评估自噬活性的可靠指标[17]。Beclin-1 是重要的自噬调控因子，其主要通过控制自噬体的形成，从而调节自噬活性[18]。在本研究中，甲酸钠处理的661W细胞，自噬水平增加，Beclin-1 蛋白表达水平增加。LC3 主要以LC3-Ⅰ和LC3- Ⅱ两种形式存在，在western blotting试验中，LC3- Ⅱ较LC3- Ⅰ变化更加明显，LC3- Ⅱ的含量能很好地反映细胞的自噬活性，因此被认为是自噬的特征标记[19]。本研究结果显示甲酸钠暴露的661W细胞，LC3- Ⅱ的表达水平增加，而LC3- Ⅰ表达水平变化不明显。p-mTOR是一种重要的信号转导分子，作为自噬的主要负调控者在蛋白合成以及自噬抑制中占据着核心的位置[20,21]，当细胞接受到外界干扰或者营养匮乏时，p-mTOR 活性受到抑制而自噬被激活。在本研究结果显示甲酸钠暴露的661W细胞，p-mTOR的表达水平减少。

总之,本研究表明,甲酸钠诱导661W细胞自噬一定程度上是通过触发JNK通路实现的。在甲酸钠作用661W细胞造成细胞损伤的过程中，自噬水平有所增加。自噬可能参与大量的视网膜疾病的发病机制.包括年龄-相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等，甲酸钠诱导661W细胞的功能障碍的研究，可能会为这些疾病发病机制的研究提供有价值的依据。

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Sodiumformateinducesretinalphotoreceptorcellsautophagy

JINYan-ling,WANGYing,CHENYue,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveIn recent years,alcoholic poisoning has occurred due to drinking fake wine.The aim of this study was to investigate the variation of cell autophagy level,in the process of sodium formate inducing retinal photoreceptor cells (661 w) damaged.Methods661W cells were exposed to 15 and 30 mM concentration of sodium formate for 24h respectively,then,the autophagy level was detected by monodansylcadaverine staining.The autophagy formation of 661W cells was observed by transmission electron microscopy.The expression of microtubule associated protein LC3,p-mTOR,Beclin 1,JNK and p-JNK were evaluated by western blotting.Intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected using 2',7'.dichlorofluorescein diacetate (DCFH.DA) staining,followed by flow cytometric analysis.ResultsCompared with the control group,sodium formate at concentrations of 15 or 30 mM markedly increased the level of autophagy level was observed under fluorescence microscope.Autophagosomes were observed under transmission electron microscope.Western blotting showed that the levels of LC3-II.Beclin 1,p JNK exhibited increased.while the expression of p-mTOR protein was decreased.And flow cytometry showed that the level of reactive oxygen species increased.ConclusionSodium formate can induce autophagy of 661W cells.Autophagy may be involved in the process of visual impairment caused by fakes poisoning.

methanol poisoning;sodium formate;autophagy;661W cells;ROS

吉林省发展和改革委员会资助项目(2015Y032-1) 吉林省科技厅资助项目(20170623093-11TC)

*通讯作者

1007-4287(2017)11-1995-05

R392

A

金艳玲(1992-)，女，在读医学硕士，主要从事青光眼及视神经疾病方面的研究。

2017-03-17)