Decorin对骨肉瘤MG63细胞侵袭和转移的影响

孙大菊，张玉成，王雅丽

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，130033; 3.吉林大学中日联谊医院 输血科，吉林 长春130033)

Decorin对骨肉瘤MG63细胞侵袭和转移的影响

孙大菊1，张玉成2*，王雅丽3*

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033;2.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，130033; 3.吉林大学中日联谊医院 输血科，吉林 长春130033)

骨肉瘤是最普遍的发生于长骨干骺端的一种恶性肿瘤。尽管最近几十年骨肉瘤的治疗取得了长足的进步，但是由于化疗药物抵抗、放疗以及辅助治疗的有限性，加之恶性骨肉瘤具有较高的侵袭和转移性，使得晚期骨肉瘤的治疗和预后的效果仍然不理想。因此，阐明骨肉瘤转移和侵袭的机制，以及寻找有效的治疗方法对于骨肉瘤的治疗和发病机理的研究将起到重要的作用[1-3]。核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是一种属于分泌型和富含亮氨酸多糖基因家族成员之一，其主要存在于结缔组织中，研究表明decorin能够抑制多种肿瘤细胞的增殖[4]。本研究将利用脂质体转染decorin基因进入到骨肉瘤MG63细胞中，探讨decorin对于骨肉瘤MG63细胞的生长、转移与侵袭的抑制作用，为进一步研究decorin抑制肿瘤的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料抗人decorin单克隆抗体(Ramp;D公司)；MTT、PI和细胞凋亡试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；western blot相关试剂来自本实验室。Transwell chamber(Corning公司)，Matrigel 基底膜(BD bioscience)；Diff-Quick试剂盒染色(Fisher scientific)。

1.2细胞培养和转染MG63细胞培养于含有10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM，置于5 % CO2、37 ℃的培养箱中。重组decorin真核表达载体(pcDNA3.1-DCN)的构建方法如前期文章所述[5]。应用脂质体2000将已构建完成含有decorin基因的真核表达载体pcDNA3.1-DCN或pcDNA3.1分别转染到MG63细胞中。本研究共分为两组：空白质粒对照组(对照组)和转染DCN实验组(实验组)。DCN蛋白的表达应用western blot进行检测。

1.3MTT检测细胞增殖情况用胰酶消化MG63细胞，吹打以制成单细胞悬液，并均匀种植于96孔板中，待细胞生长到90 %左右细胞融合时，利用脂质体进行转染，转染24 h后记为第1天，用MTT法连续3天检测细胞增殖状况。测定当天，每孔加入20 μl的5 mg/ml浓度的MTT，避光孵育4 h后弃去培养液，加入150 μl的DMSO溶解蓝紫色结晶，经振荡充分溶解后，利用酶标仪490 nm波长处测定光密度值，每组重复3次，统计分析后绘制细胞生长曲线以观察细胞增殖情况。

1.4流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡将细胞种植于培养皿中，待细胞长到90 %融化时，利用脂质体进行转染，转染第3天后，胰蛋白酶进行消化，均匀吹打，PBS清洗细胞两次，分别按照细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。细胞周期步骤大体如下：50 μl的细胞悬液加入1 000 μl 70%冰乙醇过夜，固定完全后，用PBS清洗2次，最终留有50 μl左右的细胞原液，分别加入25 μl碘化丙啶、10 μl RNase和500 μl的染色缓冲液，避光30 min，最后流式细胞仪检测细胞周期。细胞凋亡步骤大体如下：细胞悬液1 000 g离心5 min，加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC，以及加入10 μl碘化丙啶染色液，室温避光孵育20 min，最后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5划痕实验和Transwell小室法划痕实验：将细胞接种于敷有纤维粘连蛋白的平皿中，待细胞长到100 %融合时，在单层细胞表面用无菌枪头进行划痕，换掉培养基后，继续培养48 h，计算伤口愈合的百分率。每组细胞重复三次实验后进行统计学分析。Transwell小室法：细胞(5×104个)重悬在100 μl含有1 %胎牛血清的DMEM培养基中；对于迁移实验，将细胞加入到transwell chamber上层小室中，下层小室放入含有10%胎牛血清的培养基；对于侵袭实验，transwell chamber上层小室包被10 μg/ml的growth-factor-reduced Matrigel 基底膜；孵育24 h后，去除过滤膜上层的非侵袭细胞，固定过滤膜下层表面迁移的细胞并用Diff-Quick试剂盒染色和拍照。每孔中随机计算5个视野下细胞数，用每视野平均细胞数来代表侵袭程度。

1.6统计分析统计学方法采用SPSS 17.0进行t检验，数值用均值和标准差表示，Plt;0.05代表有统计学意义。

2 结果

2.1DCN蛋白表达情况Western blot方法检测对照组和实验组DCN表达情况，如图1所示，可见转染重组decorin基因后，转染组DCN蛋白表达明显高于对照组，表明本实验已经成功地将DCN基因转染到骨肉瘤MG63细胞中。

图1 转染DCN的表达情况

2.2DCN抑制骨肉瘤MG63细胞生长MTT检测发现，瞬时转染重组decorin基因第三天，与对照组相比，转染组细胞明显生长缓慢，具有统计学意义(Plt;0.05，见图2)，而转染的前两天，两者比较没有统计学意义，可见DCN能够抑制MG63细胞的增殖。

2.3DCN阻止骨肉瘤MG63细胞于G0/G1期细胞周期检测发现(见图3)，与对照组相比，转染组细胞G0/G1期细胞明显增多，而S期和G2/M期明显减少(Plt;0.05)，可见DCN可以将MG63细胞阻止于G0/G1期。

2.4DCN对于骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响细胞凋亡检测发现，与对照组细胞相比，转染组细胞凋亡数明显增多，两者相比具有统计学意义(Plt;0.05，见图4)，表明DCN可以促进MG63细胞凋亡。

2.5DCN抑制骨肉瘤MG63细胞侵袭与转移划痕实验表明转染组细胞伤口愈合百分率明显低于对照组(Plt;0.05，见图5)，Transwell小室法显示转染组细胞侵袭与转移的细胞数明显低于对照组(Plt;0.05)，这些结果共同表明DCN能够抑制MG63细胞的侵袭与转移。

图2 DCN抑制MG63细胞的生长曲线

图3 代表性的细胞周期结果图和统计结果图

图4 代表性的细胞凋亡结果图及统计结果

图5 伤口愈合实验、细胞迁移和侵袭实验

3 讨论

在本研究中，我们将decorin基因转染到骨肉瘤MG63细胞中，研究发现decorin基因能够抑制骨肉瘤MG63细胞生长、将细胞阻止在G0/G1期、促进细胞凋亡、抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移。

以前的研究表明decorin可以抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖，例如肝癌[6,7]、结肠癌[8]、乳腺癌[9]、鳞癌[10]等。另外，Decorin在许多上皮来源肿瘤中表达下调，这表明decorin可能在肿瘤的发生和发展过程中起到抑癌基因作用[11]。此外，decorin不但能够在体外抑制肿瘤细胞生长，而且在体内也能够起到相同的作用[12]。同时，许多研究显示decorin能够抑制肿瘤的转移和侵袭；比如Silvia 等研究发现移植有乳腺癌细胞的小鼠，经过DCN治疗之后，原发性肿瘤体积明显缩小；DCN能够专门靶向抑制肿瘤细胞，而对正常的细胞没有影响，而且研究还发现DCN能够显著阻止乳腺癌细胞的肺部转移；另一项研究也发现，稳定表达DCN的骨肉瘤细胞系LM8，将其注射种植于小鼠背部，观察骨肉瘤的肺转移，发现DCN能够显著延长小鼠生存的时间，而且没有发现肺部转移，可见DCN可以阻止骨肉瘤的肺部转移。这些研究均表明decorin可以抑制体内和体外多种上皮来源的肿瘤，且能够抑制肿瘤的转移[13,14]。

在本研究中，我们的成果也显示，decorin可以抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖、侵袭和转移，这将有利于阐明骨肉瘤的侵袭与转移的机制，同时为decorin抑制肿瘤的作用及其作用机制的研究奠定基础。

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吉林省卫生计生青年科研项[2014Q25]，白求恩医学科研支持计划项目[2013207058]

*通讯作者;*相同贡献

1007-4287(2017)11-1987-04

孙大菊(1980-)，女，硕士，主管技师，主要从事细胞病理学诊断及技术。

2017-01-18)