Th17/Treg细胞在各型慢性牙周炎中含量的比较分析

张 黎， 张天夫，万 惠，司 熙*

(1.海南医学院口腔医学院,海南 海口5711012;2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

Th17/Treg细胞在各型慢性牙周炎中含量的比较分析

张 黎1， 张天夫2，万 惠1，司 熙1*

(1.海南医学院口腔医学院,海南 海口5711012;2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)为最常见的一型牙周炎，约占牙周炎患者的95%。慢性牙周炎CP 可发生于任何年龄，但大多患者为成年人，35 岁后患病率明显升高，慢性牙周炎是一种多因素疾病，宿主的免疫调节在慢性牙周炎的发生发展过程中发挥了重要作用，机体免疫系统在防御病原微生物的同时会对牙周组织产生病理破坏作用。曾有学者用 Th1/Th2 理论来解释从牙龈炎到牙周炎的发展过程[1，2]，但近些年来的研究表明，Th1/Th2 模型对牙周炎发病机制的阐述具有明显的局限性，许多由 T 细胞介导的免疫反应并不能完全用Th1/Th2 模型来解释[3]，而辅助性 T 细胞 17(T helper cell 17,Th17)和调节性 T 细胞(regulation T cells,Treg)细胞的发现有助于解释一些经典的 Th1/Th2 模型存在的缺陷。Th17/Treg 的失衡在牙周炎的发病机制中起重要作用[4，5]Th17 和 Treg 在炎症和自身免疫病中的作用相互拮抗，这一观点已经被大多数学者接受。Th17 可以促进炎症和自身免疫，而 Treg 对炎症和自身免疫则有抑制作用，在自身耐受和免疫调节中起重要作用。Th17 细胞是近期发现的一类 CD4+T 细胞亚群，因其可产生白细胞介素(interleukin，IL-17)而被命名，在宿主抵御胞外菌和真菌感染时发挥作用。目前已经证明，Th17 细胞和其分泌的 IL-17在许多炎症性疾病和自身免疫病中起重要作用。Treg 细胞属于 CD4+T 细胞亚群，又被称为“抑制细胞” ，在自身免疫、抗感染免疫以及抗肿瘤免疫中发挥调节作用。Treg 细胞的功能包括抑制自身免疫、调节免疫应答以防止炎症损伤。Treg 细胞与Th17细胞一样，均由 TGF-β 诱导产生。流式细胞术(flow cytometry,FCM)能精确有效的检测出淋巴细胞亚群中Treg 细胞与Th17细胞表达的情况。

1 材料与方法

1.1主要试剂

Th17/Treg流式分析用试剂 CD4-BB515、IL-17A-PE、IL-17A-PE同型、CD4-FITC、CD25-APC、CD25-APC同型、CD127-PE、CD127-PE同型、红细胞裂解液、Stain Buffer(FBS)、固定破膜液、刺激剂+蛋白转运、抑制剂，美国BD公司。

1.2主要设备

流式细胞仪,美国BD公司;台式离心机,美国Thermo公司;恒温细胞培养箱,德国Heraeus公司;肝素纳抗凝真空采血管,美国BD公司。

1.3病例选择

选择2015.1—2015.6来我院就诊的 45例慢性牙周炎患者，男性22例，女性23例，年龄22-67 岁，平 均 (30.25±6.51 )岁，均 符合 以 下 标准[1]:(1)全身健康无系统病史；(2)近1年内无牙周治疗史；(3)近3个月无服药史；(4)至少余留20颗牙；(5)中、重度的牙周炎，多个位点探诊深度 (PD)≥5 mm，X线片显示骨丧失。院外均未使用抗生素、激素及免疫类药物，半个月内未行牙周治疗，不伴有系统的严重疾病及妊娠、哺乳期妇女，术前心电图、心肺功能及肝肾功能检查均正常，排除有高血压、恶性肿瘤及免疫系统疾病病史者。正常对照组18 例，男性 10 例，女性8例，年龄 20-69岁，平均(32.13±7.19)岁，均为正常体检者，两组一般资料比较，差异均无统计学意义(P均gt;0.05)，具有可比性。所有受试者均签署知情同意书。

1.4实验分组按照慢性牙周炎的病变程度分为四组：重度牙周炎组、中度牙周炎、轻度牙周炎组、牙周健康组(正常对照组)。前3组每组15例，对照组18例，分别抽取外周血。

1.4.1正常对照组的诊断标准：探诊无出血，全口牙的 探诊深度≤3 mm，无附着丧失，无牙槽骨吸收，无牙龈退缩。

1.4.2慢性牙周炎轻度组的诊断标准:牙龈有炎症和探诊出血，牙周袋≤4 mm，附着丧失1-2 mm，X线片显示牙槽骨吸收不超过根长的1/3,可有或无口臭。

1.4.3慢性牙周炎中度组的诊断标准:牙龈有炎症和探诊出血，也可有脓，牙周袋≤6 mm，附着丧失3-4 mm，X线片显示牙槽骨吸收或角型吸收超过根长的1/3,但不超过根长的1/2,牙可能有轻度松动，多根牙的根分叉区可能有轻度病变。

1.4.4慢性牙周炎重度组的诊断标准:牙龈炎症较明显或可发生牙周脓肿，牙周袋gt;6 mm，附着丧失gt;5 mm，X线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/2,多根牙有根分叉病变，牙多有松动[6]。

1.5方法

1.5.2流式细胞术分选Treg 细胞 ①肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2 ml，血液室温放置，8 h内进行检测，否则需弃用。②取7个流式管，分别标记空白管、CD4 抗体单染管、CD25 抗体单染管、CD25 同型对照抗体管、CD127 抗体单染管、CD127 同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100 μl 全血。③细胞表面标记染色：向CD4 抗体单染管、CD25 同型对照抗体管、CD127 同型对照抗体管、待测管分别加入1 Test 体积的CD4 抗体。向CD25 抗体单染管、CD127同型对照抗体管、待测管分别加入1 Test 体积的CD25 抗体。向CD25 同型对照抗体管加入1 Test 体积的CD25的同型对照抗体。向CD127 同型对照抗体管加入1 Test 体积的CD127 的同型对照抗体。向CD127 抗体单染管、待测管分别加入1 Test 体积的CD127 的抗体。加入抗体以后涡旋细胞3 s，并室温避光孵育30 min。④制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer 10X，货号555899)，取10X 红细胞裂解液，按照体积1(10X 红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。⑤每100 μl 全血加入2 ml 1X 红细胞裂解液，室温裂解15-30 min，至细胞悬液呈澄清透明状。⑥裂红后，500 g，离心5 min，洗涤细胞，离心后弃上清。⑦加入1 ml FBS(货号554656)，500 g，离心5 min，洗涤细胞，离心后弃上清。⑧加入350 μl FBS(货号554656)重悬细胞，上流式仪器进行分选。

1.6统计学处理

本实验所有数据用SPSS21.0软件处理，数据均以M±SD表示。组内比较采用配对t检验；各组两两比较为q检验,检验水准为α=0.05，Plt;0.05为差异有显著性。

2 结果

重度慢性牙周炎的Treg细胞/CD4细胞比值为5.6%明显高于健康对照组的4.7%，差异有统计学意义(Plt;0.05)。

中度慢性牙周炎Treg细胞/CD4细胞比值为4.2%略低于健康对照组的4.7%，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

轻度慢性牙周炎 Treg细胞/CD4细胞比值为4.6%接近健康对照组的4.7%，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

各组间比较：轻中慢性牙周炎差异不大，无统计学意义(Pgt;0.05)；轻中慢性牙周炎与重度慢性牙周炎差异明显，有统计学意义(Plt;0.05)。

重度慢性牙周炎的Th17细胞/CD4细胞比值为2.5%明显高于健康对照组的1%，差异有统计学意义(Plt;0.05)；中度慢性牙周炎Th17细胞/CD4细胞比值为1.3%略高于健康对照组的1%，差异无统计学意义(Pgt;0.05)；轻度慢性牙周炎Th17细胞/CD4细胞比值为1.4%略高于健康对照组的1%，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。轻中度慢性牙周炎之间比较差异不大，无统计学意义(Pgt;0.05)；轻中度慢性牙周炎与重度慢性牙周炎比较差异明显，有统计学意义(Plt;0.05)。

各组血清中Treg及Th17细胞含量比较见表1，2。

表1 各组血清中 Treg细胞含量比较

注：与对照组比较，①Plt;0.05；与轻中度慢性牙周炎比较②Plt;0.05。

表2 各组血清中Th17细胞含量的检测结果比较

注：与对照组比较，①Plt;0.05；与轻中度慢性牙周炎比较②Plt;0.05。

3 讨论

慢性牙周炎是发生在牙龈、牙周膜和牙槽骨等牙齿支持组织的一种常见的口腔感染性疾病,确切的发病机制仍未明了。然而牙周膜相关的微生物触发宿主免疫应答，最终导致牙齿支持组织进行性丧失为慢性牙周炎发生的主要原因之一。CD4+T 细胞是参与免疫应答的一类重要细胞，在不同的微环境及细胞因子作用下可以分化成多种亚型，其中的Th17 细胞和调节性 T 细胞( Tregulatory cells，Treg) 在分化发育过程中受到多种细胞因子的调控，参与宿主的免疫应答，发挥促进或抑制炎症反应的作用，均与牙周骨破坏有关[7]，是近年来有关慢性牙周炎免疫学发病机制的研究热点。

本实验对慢性牙周炎患者外周血中的Th17和 Treg细胞采用流式细胞术作为检测手段，比较各型慢性牙周炎与牙周健康的对照组人群外周血中Th细胞亚群中的Terg ,Th17表达水平。我们的结果显示牙周炎病人外周血中Terg ,Th17细胞比例升高，提示Terg,Th17介导的细胞免疫可能参与牙周炎的全身系统性免疫反应，并且推测两者在外周血中高表达的水平与牙周炎发病关系密切。随着慢性牙周炎病变程度的不同，Terg与Thl7的差异亦呈现显著变化。重度慢性牙周炎组Terg,Th17在CD4+淋巴细胞比例明显高于对照组。中度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴细胞比例略低于健康对照组，可能由于采血前病人进行过刮治影响了结果；轻度慢性牙周炎Terg在CD4+淋巴细胞比例接近于健康对照组；轻中度慢性牙周炎Th17细胞/CD4+细胞比例略高于健康对照组，但差异不大，无统计学意义。各组间相比较重度牙周炎Terg,Th17细胞在CD4+淋巴细胞比例明显高于轻中度牙周炎，有统计学意义。Th17 细胞是近来研究发现的机体内存在的一种新型的辅助性 T 细胞亚群，因其可以分泌 IL-17，故被称为 Th17 细胞。该细胞是由 Th0 细胞分化的，具有独立的分化发育和调节机制。Th17 细胞介导炎性反应[10]，在自身免疫或免疫应答引起的组织破坏的发病机制中起到重要的作用[11-13]，并参与肿瘤和移植物抗宿主等疾病的发生和发展，决定疾病的转归和预后[14,8]。Treg 在慢性持续感染中发挥免疫抑制作用[15]。Treg 的免疫抑制作用虽然削弱了免疫系统的抗感染作用，但也避免了过度免疫应答对机体所产生的病理损害。Cardoso 通过免疫组化方法发现牙周健康者、牙龈炎和牙周炎的牙龈组织中均有 Treg 和其细胞因子 IL-10、TGF-β 的表达，且在牙周炎组织中的表达显著增高[9]。

牙菌斑生物膜是牙周炎发生的始动因子,堆积在牙颈部和龈沟内的牙菌斑微生物及其毒性产物会刺激牙周组织导致牙周组织的破坏，并激活机体的免疫防御系统，毒性产物及其引发的炎性介质可以进入血液循环，牙周炎的进展及病变程度主要取决于宿主的免疫反应[16]。T 细胞是机体抗炎免疫应答中重要的反应细胞和效应细胞，研究表明，T 细胞与牙槽骨吸收及牙周炎的预后密切相关，活化 CD4 T 细胞产生的相关因子能够影响牙周炎的病理性破骨细胞激活与分化[17]。健康的组织中存在 Th17/Treg细胞的平衡，Th17/Treg 细胞的失衡会导致破坏性的免疫反应[18]Th17 细胞和 Treg细胞在免疫应答中起相反作用[19]。促炎性Th17细胞与抑制性Treg细胞的失衡在炎症及自身免疫病中是一个关键因素。在多种炎症中检测到 Th17 和Treg 的不同表达，认为 Th17和 Treg 对炎症的发展起到重要的作用。Treg/Th17 和其所产生的细胞因子相互作用形成一个复杂的网络。Ohlrich[2]等认为，Th17/Treg 失衡引起的自身免疫反应是造成牙周炎发生发展的因素之一。

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1.海南省自然科学基金(20158318)；2.海南医学院科研培育基金(HY2014-009)

*通讯作者

1007-4287(2017)11-1965-04

2017-01-17)