微菌落-双分子信标技术快速检测结核杆菌的应用评价

余传星 ，张 焕 ，赵自云 ，潘玉钦 ，王邱陈 ，刘 伟 ，朱 玲

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2.福建医科大学基础免疫系及神经生物学研究中心，福建 福州 350004；3.福州市晋安区疾病预防控制中心，福建 福州 350014）

微菌落-双分子信标技术快速检测结核杆菌的应用评价

余传星1*，张 焕2*，赵自云2*，潘玉钦3，王邱陈3，刘 伟3，朱 玲2

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2.福建医科大学基础免疫系及神经生物学研究中心，福建 福州 350004；3.福州市晋安区疾病预防控制中心，福建 福州 350014）

目的 探讨结核病的准确、快速、高特异性诊断方法，建立并评价微菌落-双分子信标法在结核分枝杆菌检测中的应用价值。 方法 采用MC-双分子信标技术与达安公司的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）的检测结果相比较。 结果 102份临床标本中微菌落-双分子信标法检出25份阳性，阳性率25%；达安结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒检出25份阳性，阳性率也是25%。其中各有1例阳性标本为阴性，2种检测方法比较无显著性差异（P＞0.05）。 结论 微菌落-双分子信标技术具有准确、快速、高特异性等特点，不仅可快速发现结核病患者，而且可以监测疫情，反映疾病的流行程度。

结核分枝杆菌；微菌落-双分子信标法；PCR-荧光法

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病。目前，全球已有20亿人感染结核杆菌，活动性结核患者数达1 500万，每年新发结核患者达800 万～1 000 万，有 180 万人因结核病死亡［1-4］，已成为全球的重大公共卫生问题。我国作为全球22个结核病高负担国家之一，对结核病的研究已成为人们普遍关注的热点。现有的细菌学诊断方法虽然是结核病诊断的金标准，但由于涂片阳性率低、培养耗时间，远不能满足临床需要。本文采用微菌落-双分子信标技术［5］与达安公司结核分枝杆菌检测试剂盒检测结果进行比较，以评价微菌落-双分子信标检测方法的临床应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 改良罗斯氏培养基（珠海贝索生物技术有限公司，批号A07-590B），结核杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒（中山大学自达安股份有限公司）。

1.2 标本来源 收集于福州市晋安区疾病预防控制中心就诊的结核病疑似患者的样本。

1.3 标本采集 采集患者肺部痰液标本57份，支气管灌洗液31份，胸腹水14份。收集晨痰，盛清洁干燥无菌的塑料痰瓶内送检。痰标本应以脓样、干酪样或脓性黏液样性质为合格标本，痰量为3～5mL。

1.4 样本前处理 取3～5 mL标本置于50 mL离心管中，加入1～2倍的4%NaOH溶液，放于振荡器上充分振荡20 min，再加入40 mL PBS缓冲液，充分混匀后经3600 rpm离心20 min，弃上清液，加入2 mL生理盐水与沉渣混匀后备用。

1.5 微菌落培养 取10μL待测标本接种于培养基上的微菌落膜表面，用L型玻棒涂匀，同时接种多张膜，分别用于微菌落的形态观察和提取DNA之用。将接种了标本的培养基置于37℃，5%CO2的孵箱培养14 h后，细菌膜进行透明、固定、封膜等特殊处理后在显微镜下观察是否有细菌生长及微菌落的形态。

1.6 荧光定量PCR 用热裂解法提取膜上微菌落的DNA分别进行微菌落-双分子信标检测及荧光定量PCR。参照本实验室之前建立的双分子信标检测方法［6］进行荧光定量PCR实验。达安公司结核分枝杆菌检测试剂盒则按说明书进行操作。

1.7 统计学方法 数据处理采用SPSS 16.0统计学软件，计数资料采用χ2检验。

2 结 果

MC-双分子信标法与达安结核分枝杆菌检测试剂盒检测结果显示，MC-双分子信标法检出25份阳性，阳性率25%；达安结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒检出25份阳性，阳性率也是25%。其中各有1例阳性标本为阴性，2种方法比较无显著性差异（P＞0.05），见表 1。

表1 微菌落-双分子信标法与达安结核分枝杆菌检测试剂盒检测结果比较

3 讨 论

快速检测结核杆菌及其耐药性一直是国内外学者研究的热点，依据检测原理可以分为表型和基因型检测，所谓表型检测是通过观察结核杆菌形态及分离培养进行鉴定。尤其是检出痰中含有结核分枝杆菌是临床诊断肺结核或鉴别肺结核与其他肺病的重要依据［7-8］，而痰中结核杆菌的检测方法常规采用痰涂片及痰培养。涂片虽快速、价廉、简单易行，但敏感性低，通常需5 000～10 000条菌／mL才能得到阳性结果，特异性差，各种分枝杆菌均可着色，无法区别死菌与活菌［9-10］。本研究中将培养法与分子生物学方法相结合，从而建立了MC-双分子信标法快速诊断法。

本研究应用微菌落-双分子信标法，与达安公司结核分枝杆菌检测试剂盒检测结果比较，2种方法无显著性差异；但微菌落-双分子信标检测方法不仅能够在14 h内观察微菌落形态，还能够区分死菌还是活菌，帮助流行病学的诊断，所以微菌落-双分子信标检测方法具有准确、快速、敏感、特异等优点，有望成为结核病快速筛查诊断的新方法。

［1］ KURTHKOTI K，AMIN H，MARAKALALA M J，et al.The capacity of Mycobacterium tuberculosis to survive iron starvation might enable it to persist in iron-deprived microenvironments of human granulomas ［J］.MBio，2017，8（4）：e01092-17.

［2］ WORLD HEALTH ORGANIZATION.Annual Report-Global Tuberculosis Report.Geneva：WHO，2014.

［3］ SINHA N，MISHRA G J.Psycho-social problems of TB patients：a social work intervention ［J］.JHSS，2015，20 （4）：81-85.

［4］ DIEL R，LODDENKEMPER R，ZELLWEGER J P，et al.Old ideas to innovate tuberculosis control：preventive treatment to achieve elimination ［J］.Eur Respir J，2013，42（3）：785-801.

［5］ YU C X，ZHAO Z Y，LV J X，et al.A dual molecular beacon approach for fast detection of Mycobacterium tuberculosis ［J］.Mol Biol Rep，2013，40（2）：1883-1892.

［6］ 余传星，赵自云，潘玉钦，等.荧光定量PCR在结核杆菌微菌落培养研究中的应用［J］.福建中医学院学报，2009，19（6）：51-53.

［7］ BLAKEMORE R，NABETA P，DAVIDOW A L，et al.A multisite assessment of the quantitative capabilities of the xpert MTB／RIF assay ［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，184（9）：1076-1084.

［8］ BARK C M，OKWERA A，JOLOBA M L，et al.Time to detection of Mycobacterium tuberculosis as an alternative to quantitative cultures ［J］.Tuberculosis （Edinb），2011，91（3）：257－259.

［9］ PETER JG，THERON G，SINGH N，et al.Sputum induction to aid diagnosis of smear-negative or sputumscarce tuberculosis in adults in HIV-endemic settings ［J］.Eur Respir J，2014，43（1）：185-194.

［10］ SHU C C，WANG JT，LEE C H，et al.Predicting results ofmycobacterial culture on sputum smear reversion after anti-tuberculous treatment：a case control study ［J］.BMC Infect Dis，2010，10（48）：1-7.

R378.91

A

1000-338X（2017）05-0036-01

2017-08-24

福建省社会发展引导性重点项目（2014Y0058）

*并列为第一作者。

朱玲（1962—），女，教授。 E-mail：lingzhu29@sina.com