乌头汤对膝骨关节炎大鼠细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影响

陈 俊 ，叶锦霞 ，林 洁 ，付长龙 ，刘献祥 ，吴广文

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

乌头汤对膝骨关节炎大鼠细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影响

陈 俊1，叶锦霞2，林 洁2，付长龙2，刘献祥2，吴广文2

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

目的 通过观察乌头汤对膝骨关节炎大鼠血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的影响，探讨其治疗膝骨关节炎的作用机制。 方法 采用随机数字法将60只SD大鼠分为空白组15只和造模组45只。造模组在第1、4、7天采用4%木瓜蛋白酶关节腔内注射复制膝骨关节炎模型。成功造模后，随机分为模型组、对照组和治疗组各15只。空白组和模型组灌服0.9%生理盐水；对照组灌服双氯芬酸钠缓释胶囊；治疗组灌服乌头汤。2周为1个疗程，疗程期间休息2 d，共干预4个疗程。观察4组大鼠一般情况、关节液情况及血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3浓度变化。 结果 与空白组比较， 模型组血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3浓度明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，对照组与治疗组血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3浓度均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，治疗组血清和关节液中IL-6浓度明显升高（P＜0.05）。 结论 乌头汤通过降低血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎症反应，降低细胞外基质降解，减缓软骨退变，从而起到治疗KOA的目的。

膝骨关节炎；IL-1β；IL-6；TNF-α；MMP-3；乌头汤

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）属中医“痹症”范畴，是中老年人常见病，以关节疼痛、活动障碍为主要特征的慢性退行性疾病［1］。研究发现炎症因子与KOA发生发展密切相关［2-6］。中医药防治KOA有一定优势［7-8］，但其作用机制不明。乌头汤出自东汉·张仲景《金匮要略》，长期应用于风寒湿痹型KOA的临床治疗，疗效可靠。本实验拟通过观察乌头汤对KOA大鼠血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影响，探讨乌头汤治疗KOA的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 60只清洁级2月龄雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 实验药物 乌头汤药物组成：川乌6 g，麻黄9 g，黄芪 9 g，芍药 9 g，甘草 9 g，由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供。双氯芬酸钠缓释胶囊（中国药科大学制药有限公司）。

1.3 实验试剂 IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-3酶联免疫试剂盒（美国R&D systems公司）；水合氯醛粉末（国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 实验仪器 ELx800型全自动酶标仪（美国BioTek公司）；Allegra 64R低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；H-1微型混合器（上海康禾光电仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 乌头汤药液的制备 先将制川乌浸泡30 min后水煎煮 1 h，再加入剩余中药煎煮1 h，过滤取药液。将药液水浴浓缩至含生药量为4.2 g／mL，冷却后置于 4℃冰箱保存，备用。

2.2 动物分组与造模 SD大鼠60只，采用随机数字表法分为空白组（15只）和造模组（45只）。造模组SD大鼠于第1、4、7天采用膝关节腔注射4%木瓜蛋白酶复制膝骨关节炎模型［9］。术后2周，将造模组随机分为模型组、对照组、治疗组各15只。

2.3 药物干预 空白组和模型组按照3 mL／（kg·d）予0.9%生理盐水灌胃。动物给药剂量换算参考文献［10］，对照组给予双氯芬酸钠缓释胶囊（1 mg／mL），灌胃量根据大鼠每周体质量按照10 mL／（kg·d）计算；治疗组给予乌头汤（4.2 g／mL），灌胃量根据大鼠每周体质量按照 10 mL／（kg·d）计算。2周为1个疗程，共干预4个疗程，疗程期间休息2 d（给药期间，每周称1次体质量以调整给药剂量）。

2.4 取材 干预4个疗程后，予10%水合氯醛麻醉，膝关节备皮，逐层分离至关节囊，反复活动膝关节，将关节液挤压至髌上囊内侧，于其髌韧带附着点外上方，用1 mL医用注射器穿刺入关节腔内，注入0.9% 氯化钠注射液0.5 mL，抽取关节液，置入EP管中，－20℃保存，待检测。抽取关节液后，常规腹主动脉采血，3 000 rpm离心15 min，吸取上层血清，－20℃保存，待检测。

2.5 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3浓度检测 用ELISA法检测血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3的浓度。具体如下：空白孔加样品稀释液100μL，余孔加待测样品 100μL，酶标板覆膜，37℃反应120 min。每孔加生物素标记抗原工作液100μL，37℃反应60 min。洗板3次。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，37℃反应60 min。弃去孔内液体，洗板3次。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色。依序每孔加终止液50 μL，终止反应。在加终止液后15 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。以标准品浓度作为横坐标，OD值作纵坐标，计算出标准曲线的4-Parameter回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析；不符合正态分布采用秩和检验。

3 结 果

3.1 一般情况 ① 空白组大鼠皮毛光亮，喜活动，反应良好，饮食正常；② 模型组大鼠皮毛暗淡，膝关节肿胀明显，患肢拒碰、不愿活动，被动活动时出现跛行或患肢拖行，懒食；③ 治疗组与对照组大鼠干预后膝关节肿胀程度均减轻，主动活动时间增加，反应灵敏，食量增加，2组比较无明显差别。

3.2 关节液变化 空白组大鼠关节液无色、透明清亮、黏稠状；模型组大鼠关节液呈淡黄、半透明，浓稠偶见白色絮状物，量增多；治疗组和对照组大鼠关节液呈淡黄、透明，无絮状物，量正常。

3.3 4组血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3浓度比较 见表1。

表1 4 组血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 浓度比较（x±s）pg／mL

3.4 4组关节液IL-1β、IL-6、TNF-α和 MMP-3浓 度比较 见表 2。

表2 4 组关节液 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 浓度比较（x±s）pg／mL

4 讨 论

近年来，研究发现细胞因子与膝骨关节炎进程密切相关［11-12］。MMPs是一类广泛存在于全身结缔组织中的一种蛋白酶，在膝骨关节炎病理过程中，滑膜细胞和软骨细胞分泌过量MMPs，打破MMPs及其抑制剂TIMPs的平衡，使MMPs相对增多。而MMPs能直接切断软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，导致胶原网受到破坏，细胞外基质成分游离出软骨，使软骨受损并失去弹性，原本被关节软骨基质包埋的软骨细胞在力学和炎性因子的作用下发生凋亡，最终导致软骨破坏［13］。MMP-3又名间充质降解素，作为MMPs家族中的重要酶类，MMP-3主要通过参与间质胶原酶的激活来降解Ⅱ型胶原，并能激活其他蛋白酶原，加速软骨的破坏进程。研究表明骨关节炎患者血清和关节液中MMP-3含量较健康人增高，其表达水平与软骨破坏程度相一致［14］。IL-1β可诱使软骨细胞内线粒体功能紊乱，导致活性氧的产生，进而通过死亡受体途径刺激软骨细胞死亡区域蛋白mRNA的表达，介导软骨细胞凋亡，从而破坏软骨层结构，导致 OA 的发生与发展［15］；IL-1β 还可通过诱导软骨细胞外基质层中MMPs的表达，进一步破坏软骨结构［16-18］。TNF-α是炎症反应的重要调节剂，在OA发病和进展中起着关键作用。TNF-α作用机制与IL-1β类似，两者具有协同作用［19-21］。IL-6是一种在Ⅱ-1、TNF-α等诱导下由巨噬细胞、软骨细胞、破骨细胞等细胞产生的细胞因子，具有激活 B细胞和 T细胞等多种生物学活性。此外，IL-6可增加滑膜组织炎症细胞，刺激软骨细胞增殖，诱导放大 IL-1β增加 MMP的合成作用和抑制蛋白多糖产生，形成恶性循环，加速软骨破坏进程［22-23］。

乌头汤出自《金匮要略》：“病历节不可屈伸，疼痛，乌头汤主之。乌头汤方：治脚气疼痛，不可屈伸。”主治寒湿痹阻，阳气不通所致的寒湿历节。方中制川乌为君药，有温经散寒止痛的作用；麻黄为臣药，能祛风发汗通阳行痹；芍药缓急止痛，使阴阳宣通，气血畅行，利关节屈伸；黄芪益气固卫，助温经止痛时，又可防麻黄过于发散，有扶正祛邪之效，两药共用为佐药；炙甘草为使，合益气减毒之功。诸药合用，共奏温经散寒，祛湿止痛之效，能针对KOA痹症的病因病机起治疗作用。本实验结果显示，与空白组相比，模型组血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3水平均明显升高，而经过乌头汤治疗后，IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3 水平均明显降低，提示乌头汤治疗KOA的作用机制可能是通过降低血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量，抑制炎症反应，降低细胞外基质降解，减缓软骨退变，从而起到治疗KOA的目的。

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R285.5

A

1000-338X（2017）05-0027-03

2017-05-02

福建省卫生计生青年科研课题（2017－2－46）；陈可冀中西医结合发展基金（CKJ2016010）

陈俊（1986—），女，主要从事中西医结合防治骨关节炎研究。

吴广文（1982—），男，医学博士，副研究员。E-mail：wuguangwenfj@163.com