糖化血红蛋白概论及其临床检验标准化进展

2017-11-22廖远泉

临床检验杂志(电子版) 2017年1期

关键词：珠蛋白糖基化糖化

廖远泉

述评

糖化血红蛋白概论及其临床检验标准化进展

廖远泉

糖化血红蛋白；生物化学；标准化；临床检验

作者单位：242500 泾县，安徽省宣城市泾县医院检验科

1 序言

糖基化血红蛋白（glycosylated hemoglobin ）是伊朗科学家Ranbar等应用琼脂糖凝胶电泳分析率先从糖尿病患者血液中发现的一种血红蛋白组分，且研究表明，是血液葡萄糖对HbA的非遗传修饰产生了糖化血红蛋白A1c（haemoglobin A1c,HbA1c）[1,2]。从此，他们与糖尿病的相关性得到确认，这一发现奠定了HbA1c检测用于糖尿病的初筛和诊断的基础。

美国糖尿病控制及并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial,DCCT）和英国前瞻性糖尿病研究（UK Prospeetive Diabetes Study,UKPDS）历时多年的糖尿病流行病学研究表明糖尿病患者通过治疗，控制平均血糖水平和HbA1c，能够有效地得到治疗，显著降低视网膜病变、肾脏疾病以及神经病变等并发症的发生及其严重程度。而且，糖尿病终末事件的发生率均有随着HbA1c的增高而增加的趋势，提示糖尿病患者并发症的减少与HbA1c的降低密切相关[3]。DCCT&UKPDS的研究为糖尿病探索新的实验诊断方法及其检测指标做出了划时代的贡献。进一步明确了HbA1c在糖尿病治疗及并发症监测中具有重要价值。本文解析了糖化血红蛋白生物化学及其临床检验标准化的相关进展，以期为我国糖尿病防治及其临床研究有所借鉴。

2 糖化血红蛋白的生物化学

2.1 糖化血红蛋白的定义国际临床化学与医学实验室联盟，亦称“国际临床化学与检验医学联合会”（Internatiomnal Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC）命名、属性和单位委员会（Nemenclature,Properties and Units,C-NPU）所定义的糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin A1c）应该概括为：“人体血液中glucose与hemoglobin β链N-末端缬氨酸（βN-1-去氧果糖基血红蛋白）残基以共价键结合的稳定的一类化合物”，其化学结构通常为具有一个特定六肽的血红蛋白分子[4]。全名：血红蛋白β链（血液）-N-(1-去氧果糖-1基) 血红蛋白β链[5]。

2.2 血红蛋白及其组分

2.2.1 血红蛋白及其组成血红蛋白（hemoglobin,Hb）其分子结构是一种由1个珠蛋白和4个血红素（又称亚铁原卟啉）组成的结合蛋白。其相对分子质量为64,000[6]。

血红素是由原卟啉环和亚铁原子（4个吡咯基组成一个环、中心为一铁原子）组成，铁为亚铁（Fe2+）、卟啉是原卟啉IX，血红素主要在线粒体中生成。而不同Hb分子的珠蛋白的多肽链的组成不同，其肽链是在胞浆中的多聚核糖体上由氨基酸连接生成。一个珠蛋白的分子的2对多肽链，一对是由141个氨基酸残基构成的α多肽链；另一对即由β、γ、δ、ζ（结构与α链相似）以及θ链组成的非α多肽链（有146个氨基酸残基）。每一个Hb单体由珠蛋白的一条肽链与一个血红素相联接所构成。人类Hb是由2对（共4条）Hb单体（或者称为“亚单位”）聚合而成的四聚体。血红素的结构均相同，但不同类型的Hb其珠蛋白结构可略有不同。

成年人Hb（HbA）的多肽链是2条α链和2条β链结构。胎儿Hb（HbF）为2α2γ结构，出生后不久HbF即为HbFA所取代。健康人出生后生成的Hb分为3种：HbA（2α2β,95%-97%），为人体主要的Hb，在胚胎2个月时HbA即有少量出现，当出生时HbA可占Hb总量的10%-40%，出生6个月后即可达成人的水平；HbA2（2α2δ,2.5%-3.0%）出生后6个月-12个月才开始产生；以及HbF（2α2γ,0.5%-1.0%）出生时可达体内Hb总量的70%-90%，此后即逐渐减少，直至出生6个月后其浓度降低到Hb总量的0.5%-1%左右。多肽链中氨基血红素的[Fe2+]均连接在多肽链的组氨基酸残基上，这个组氨酸残基如果被其他氨基酸所取代，或其邻近的氨基酸有了改变，都会影响Hb的功能。

HbA中大约90%为非糖化血红蛋白（HbA0）。5%-8%为糖基化血红蛋白（HbA1）。

2.2.2 血红蛋白相关的基因突变 Hb的肽链受不同的遗传基因所控制。珠蛋白基因突变使得肽链的单个/或者多个氨基酸残基之一缺如或者被其他氨基酸残基置换，因此，珠蛋白分子的结构改变，被改变了分子结构的珠蛋白称之为异常血红蛋白（abnormal hemogloin）或称为血红蛋白变异体（hemoglobin variants）。通过Hb结构检测分析全球已发现的异常血红蛋白到20世纪90年代达600多种。例如：（1）遗传性黑血症（Hb IWATE，α链的第87组氨酸→酪氨酸）、镰状红细胞贫血（HbS，β链的第6谷氨酸→缬氨酸）；（2）构成珠蛋白的α链、β链、γ链、δ链，其中任何一条多肽链由于合成缺陷，正常Hb生成不足而引起贫血。例如：β-地中海贫血症，因为β链缺如，正常的HbA减少，相应地HbF、HbA2则生成增多；又如α-地中海贫血症则是因为α链缺少所致，出现汉氏小体等与β-地中海贫血相似，但因α链参入多种Hb的组成，故其影响可以涉及HbA、HbF以及HbA2，同时还可能出现由4条β链组成的HBH（β4）；或者（3）由4条多肽链其中一种珠蛋白链构成的不稳定的异常血红蛋白，例如由4条γ链组成的Hb Barts（γ4）；（4）多个氨基酸残基缺失或过剩的异常血红蛋白（Lepore型）。然而，约2/3以上的异常血红蛋白基因携带者未出现明显的临床症状。据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）初步评估，全世界变异血红蛋白（HbS、HbC、HbD、HbE等）基因携带者可能已有150,000,000之多，严重危害人类健康。

2.2.3 糖基化血红蛋白及其生物化学特点 HbA1由与果糖-1,6二磷酸相结合的HbA1a1（约1.6%）、与葡萄糖-6磷酸相结合的HbA1a2（约0.8%）、与其他碳水化合物相结合的HbA1b以及与葡萄糖相结合的HbA1c（约5%）等几种成分组成。本文叙述的糖基化血红蛋白所指代的是HbA1c，因为它是糖基化血红蛋白（Glycatcd hemoglobin）这一类化合物中的主要组成成分，大约占糖基化血红蛋白总体量的60%。目前，临床应用和实验室定量检测的是HbA1c组分或者“相当于HbA1c”组分。因为，糖尿病患者每一个体的血液中Hb浓度水平不同，故HbA1c量的表述方式应以占个体总的Hb的“百分比”表示HbA1c的浓度较为合理。

研究[7,8]表明非糖化，即天然的Hb是HbA（2α2β链），Hbβ链N-末端缬氨酸的游离氨基，以及其他游离的氨基（α链N-末端缬氨酸、赖氨酸δ-氨基）可以与不同的碳水化合物糖基化，形成糖基化亚组分，包括HbA1a1、HbA1a2、HbA1b以及HbA1c。这些糖基化亚组分统称为总糖化血红蛋白（haemoglobin A1,HbA1）。少量的胎儿血红蛋白［fetal hemoglobin,HbF（2α2γ链）］及HbA2（2α2δ链）γ链或者δ链N-末端缬氨酸以类似的方式被糖基化，生成HbA2c。

在机体内，葡萄糖的游离醛基与Hbβ链N-末端缬氨酸氨基之间进行非酶促结合反应，首先形成不稳定的醛亚胺（Schiff碱），然后经过Amadori转位，葡萄糖胺缓慢地分子重新编排，经缩合反应形成稳定、不可逆的酮胺化合物。最终，前期反应生成物经过一系列氧化、脱水、缩合、环化等反应，其分子间产生交联或者断裂，形成一组具有生物学活性的HbA1c。且研究[7,8]证实机体中的糖化反应产物（advanced glyeation end product,AGES）可以分为荧光/交联和非荧光/非交联两类。这些糖化血红蛋白有的已经制备了单克隆抗体，可以采用免疫学分析技术进行检测，也可以核酸水解后再采用高效液相层析技术或者气相/质谱分析技术进行检测分析。

HbA1c与红细胞的生存密切相关[6]。人体血液有形成分中红细胞的生存时间最长，其半衰期长达3个月，血液中高浓度的葡萄糖不仅逐渐渗入红细胞膜结构，且渗透进入细胞浆内，细胞浆内的Hb亦被“糖基化”。其合成反应速率与生命周期约120 d的红细胞的糖化量呈正比函数关系。因此，在临床上它反映了糖尿病患者近期2个月-3个月平均血糖的控制水平。HbA1c与空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose toierance test,OGTT）中的葡萄糖峰值（2 h postprandial glucose,2hPG）及糖尿病受试者工作曲线（receiver operating characteristic,ROC）下面积、平均血糖（mean blood glueose,MBG）水平等，均具有相关性。与传统的糖尿病诊断指标——血糖相比[9]，HbA1c具有生物学变异性小、不易受血糖波动的影响、也不需要空腹或者特定的时间采血，分析前的不稳定性小等显著特点。是近些年已经在国际上广泛应用的一个新的糖尿病诊断指标[10,11]。

3 糖化血红蛋白临床检验国际标准化

HbA1c并不是均一的一组加合物，它可以与葡萄糖交联结合的位点有：β-N-Val-1、α-Lys-16、β-Lys-66、β-Lys–17、α-N-Val-1、α-Lys–7以及β-Lys-120等结合位点，其中β-N-Val-1位点是IFFC所定义的HbA1c化学结构。化学反应中可以捕获到的物质亦有所不同，因此各自的检测方法亦不尽相同。所以，其被测量也不一致。这取决于HbA1c定量分析的试验原理，完全依赖于被检测物质的化学定义。临床实验室各种检测HbA1c的试验技术和方法已达30多种。根据其实验原理，这些检测技术和方法主要分为两类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所携带电荷性质的不同，例如离子交换层析法、电泳分析法；另一类是基于糖化和非糖化血红蛋白的分子结构不同，如免疫层析法、亲和层析法、酶法等。不同的试验方法或分析技术其所根据的实验原理不同，所检测的Hb组分亦不同。例如，离子交换色谱法检测的是HbA1c；而亲和层析法测定的是总血红蛋白等。

鉴于DCCT/UKPDS研究所达成的共识，世界防治糖尿病形势和临床对于HbA1c有了更加广泛应用的需要。为了将DCCT/UKPDS的研究成果应用于临床，就必须使世界各个临床实验室的HbA1c检验结果与DCCT的检验结果具有“可比性”。应全球标准化的需要，在世界范围内有资格可以百分值报告HbA1c检测结果的临床实验室必须获得NGSP的认证。因此，在临床检验实践中催生了HbA1c的国际标准化。

3.1 IFCC的糖化血红蛋白临床检验“国际标准化” HbA1c国际标准化工作的进程中，NGSP以及DCCT做了大量开创性的“标准化”工作。但是，NGSP/DCCT的标准化的唯一依据只是将密苏里大学实验室的Bio-Rex 70树脂高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）的检测结果认定为标准检验结果。但是，缺乏任何一种HbA1c参考物质或确认该物质的参考方法[12]。

为了统一HbA1c临床实验室检测的国际标准，IFCC于1995年成立了HbA1c标准化工作组。工作组建立并确认了HbA1c临床检验实验室2个候选的参考方法、制备了HbA1c/HbA0（即糖化血红蛋白/非糖化血红蛋白）参考物质。同时，决定以此作为全世界临床实验室HbA1c可比性分析的基础。并建立了参考实验室网络。据相关讯息，截止2015年1月，全世界已有150家临床实验室获得了NGSP资格水平1、资格水平2的实验室认证。在参考系统建设方面，我国迄今已经有上海市临床检验中心（2011）、国家卫生部临床检验中心（2013）、北京市临床检验中心（2014）先后通过 IFCC认证并被接纳成为HbA1c一级参考实验室。

3.1.1 HbA1c 被测量的确定 IFCC确定了HbA1c被测量及其参考检测程序/方法。“明确了该程序测定的是单一分子属性，其检测结果为“物质组分的量（mol），并可以溯源至国际单位制（Intemational System of Urits,SI）。IFCC C-NPU认为：所有具有β链N–缬氨酰-1-果糖基血红蛋白可以被IFCC参考测量程序特异地测量，所以在计量单位上可以溯源至SI单位（mmol/mol）。故此，IFCC的参考测量程序检测的“被测量”十分明确，其检测的非糖化血红蛋白为β链血红蛋白（HbA0）、所检测的糖化血红蛋白为β链N–缬氨酰-1-果糖基血红蛋白［HbA1c，即β链（N-脱氧果糖基）血红蛋白］”[5,6,12]。

3.1.2 HbA1c参考检测系统的建立与确认 IFCC在建立的参考实验室网络中，以确认的高效液相色谱/电雾化质谱（high performance liquid chromatography/massspectrometry,HPLC-MS）或者高效液相色谱/毛细管电泳（high performance liquid chromatography/capillary electroplioresis,HPLCCE）参考分析方法进行检测[13]，应用研发的纯度为98%的HbA1c/HbA0参考物质予以校准，试验检测结果可以溯源到SI单位（mmol/mol）；其室内变异系数（coefficient of variation,CV）为0.47%-2.07%，室间CV为1.35%-2.27%。使得全球各个临床实验室HbA1c的每一检测方法的检测结果都具有可比性、实现溯源性[12,13]。

HbA1c参考方法的实验原理：依据对血红蛋白β链-N端的特定结合位点的检测。“完整的血红蛋白分子以胞内蛋白内切酶Glu-C水解，其水解产物为HbA1c的β链-N端的六肽多肽。继以反向HPLC技术分离这些六肽多肽，并由HPLC-MS或者HPLC-CE进行定量分析。这种以水解获得的多肽分离技术进一步提高了对HbA1c的分辨能力”。经过多年的继续跟踪研究，上述的研究结果已经得到确认是稳定且可靠的。

3.2 HbA1c临床检验国际标准化 IFCC、ADA、欧洲糖尿病研究学会（European Association for the Study of Diabetes,EASD）、国际糖尿病学会（International Diabetes Federation,IDF）以及国际儿科与青少年糖尿病协会（International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes,ISPAD）等几个国际糖尿病学术组织分别于2007年/2010年研讨会议后，共同发表了关于在全球临床实验室实施HbA1c标准化的《联合声明》。《联合声明》的主要内容[14]：实现全世界临床实验室HbA1c标准化（包括参考系统以及检测结果报告）；重申了IFCC参考系统是HbA1c标准化的唯一有效系统；HbA1c以IFCC的SI单位（mmol/mol）以及所推导的NGSP（%）百分比单位报告，使用IFCC-NGSP一级等式所推导的转换方程，NGSP（%）=（0.091,5×IFCC（mmol/mol）+2.15）。例如：5%=33 mmol/mol 。

全球临床实验室实施HbA1c标准化的《联合声明》2007年/以及2010年的再次发布，开启了HbA1c临床实验室国际标准化的序幕。2010年，ADA将HbA1c列入糖尿病诊断《指南》[1]；同年，为了规范我国糖尿病的临床实验室诊断，中华医学会检验分会发布了《糖尿病诊断诊疗中实验室检测项目的应用建议》，并启动了《中国糖化血红蛋白教育计划》。2011年，又颁布了《糖化血红蛋白实验室检测指南》。

2011年1月WHO发表了《应用糖化血红蛋白诊断糖尿病》的咨询报告[15]，报告中指出：HbA1c的测定在具有严格的质量控制保证、并能够溯源至一个国际标准化参考体系，且不存在干扰其测定结果准确性的情况下，HbA1c可以作为糖尿病的诊断试验。同时推荐HbA1c≥6.5%作为糖尿病诊断切点。HbA1c临床检验实现国际标准化这一重大决定，为世界临床实验室HbA1c检测结果的可比性奠定了基础。

4 展望

Bonora等[3]一项多年的将HbA1c水平进行分层的流行病学研究显示，当HbA1c为5.50%-5.99%范围时，今后临床发生糖尿病的风险增加近4倍，当达到6.00%-6.49%水平时临床发生糖尿病的风险已增加12.5倍。提示HbA1c 6.00%-6.49%水平时具有重要的糖尿病预警作用，并已存在糖代谢异常。但也有较多有关HbA1c≥6.5%切点的研究结果虽然反映了不同人群、多种影响因素可能导致HbA1c切点的差异。同时，HbA1c在临床应用时也有某些局限，其可能受到妇女妊娠、血液透析、血红蛋白病、溶血以及红细胞生存周期改变等多方面因素的影响[7,16,17]。有一些干扰因素及其干扰程度取决于所采用的检测方法（方法学特异），而有一些干扰无论采用哪一种检测方法都无法解决（非方法学特异）。Ji等[18]研究证实不同的分析系统其干扰因素是不同的。Weykamp等[19]研究发现血红蛋白变异体和血红蛋白A两者之间的糖化率的差异，可致其检测结果的差异尤以亲和层析法产生的偏差更为显著。Herman等[20]研究认为ADA推荐值HbA1c≥6.5%，具有特异性高、但敏感性低的矛盾未能解决。由此得出不能单用HbA1c作为糖尿病诊断标准的结论。有必要结合FPG、随机血糖、或者OGTT共同或互相补充以确定糖尿病的临床诊断。正如著名检验医学专家冯仁丰[12]所指出的那样，任何事物总有不足之处。尤其有关异常血红蛋白对于HbA1c检测结果的影响尚乏客观的判断和研究。所以，为了保证HbA1c检测结果的准确性，根据HbA1c水平对糖尿病患者进行治疗监测，应该积极、认真做好HbA1c检测的室内质量控制；同时亦应积极参加室间的质量评价以验证实验室检测结果的可靠性、可比性，逐步提升检验技术人员的检测技术水平。也是积极参入HbA1c国际标准化工作的主要体现方式。2015年6月23日，国家卫生和计划生育委员会发布了《中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 461-2015）-糖化血红蛋白检测》[21]，且于2015年12月31日实施。HbA1c检测国家标准的实施，为HbA1c检测结果的可比性有了我国统一的、规范化的国家标准，为HbA1c临床检验实现国际标准化做出了重要贡献。

期待我国的HbA1c临床检验国际标准化一定会蓬勃发展到新的、更高的水平。HbA1c是诊断和监测糖尿病的金标准[22]，为加快融入国际标准化的进程，我国的检验医学工作者应该更加努力。

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Overview of glycosylated hemoglobin and progress on its standardization of clinical research

Yuanquan LIAO
Department of Clinical Laboratory,Jing County Hospital of Anhui Province,Xuancheng 242500,China

Haemoglobin A1c; Biochemistry; Standardization; Clinical Laboratory