损伤相关分子模式与器官移植

曹 溆 综述 张克勤 审校

(第三军医大学第一附属医院肾科，重庆 400038)

损伤相关分子模式与器官移植

曹 溆 综述 张克勤 审校

(第三军医大学第一附属医院肾科，重庆 400038)

在器官移植中，缺血再灌注损伤(IRI)是一个无法避免的过程，其对移植物的最终结局有重要影响，延长缺血时间会导致发生急慢性排斥反应风险增加，在人肾移植中，冷缺血时间从6 h增加到30 h会导致移植失败的风险增加40%[1]。IRI会引起一定程度的移植物坏死，通过释放损伤相关分子模式(DAMPs)激活模式识别受体(PRRs)诱发无菌性炎症，其引起的先天性免疫反应早于获得性免疫反应。IRI过程中释放的DAMPs会激活移植物内先天性免疫细胞(比如巨噬细胞、树突状细胞)释放趋化因子，使受体的免疫细胞向移植物迁移导致进一步的移植物内的免疫反应，然后这些免疫细胞离开移植物进入局部排泄性淋巴结启动抗供体特异性免疫反应[2]。Hoffmann等[3]也发现由DAMPs诱发的信号传导通路使先天性免疫细胞向移植肾的迁移早于T细胞，这一过程的最终结果即产生移植排斥反应。因此明确这些在器官移植时释放的先天性免疫的配体、相应的受体及信号通路，有可能提供一个新的治疗方法，在移植前局部运用于移植器官来减少移植物炎症、减少免疫抑制剂的剂量、改善患者的预后。本文就DAMPs、其相关受体、信号传导通路在器官移植中的相关进展做一综述。

1 损伤相关分子模式(DAMPs)

先天性免疫受体通常被统称为模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)，其配体损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)与病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns ，PAMPs)是一组对应的概念。DAMPs是细胞核或细胞浆内的一群分子，通常隐蔽于免疫系统之外，当PRRs识别的配体来源于组织损伤产生的内源性物质时，这些内源性物质即DAMPs，例如高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1,HMGB1)[4]。当PRRs识别的配体为病原体时，这些病原体通常被称为PAMPs,例如革兰阴性细菌细胞壁主要成分脂多糖就是一种经典的PAMP。过去20年虽然人们对于先天性免疫的认识有了很大的提高，但这些认识主要来源于对病原体引起炎症的研究。非病原体激活物同样会引起炎症反应，这种炎症通常被称作无菌性炎症(Sterile inflammation)，同样会激活先天性免疫系统，产生一系列后续效应，对疾病的发生、发展产生重要的影响。无菌性炎症在急慢性情况下均可以产生，急性情况包括缺血再灌注损伤(Ischaemia-reperfusion injury，IRI)、外伤、毒素暴露等，慢性情况包括粒子引起的肺部疾病(石棉肺、硅肺)、心血管疾病(动脉粥样硬化)、某些肿瘤等[5]。

1.1高迁移率族蛋白B1(HMGB1) HMGB1是一种典型的损伤相关模式分子(DAMPs),因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率快而得名,它是一种普遍存在的核蛋白，其作为损伤相关的分子模式和晚期炎症介质，涉及先天性免疫的各个方面,同时还与细胞自噬和凋亡等主要细胞过程有关。HMGB1在细胞核中起着DNA伴侣的作用，但它在细胞损伤或感染性刺激时表现出细胞因子样活性。细胞外HMGB1通过特定的受体作用，促进NF-κB信号通路的激活，导致细胞因子和趋化因子的产生[6]。它参与稳定核小体的结构、调节染色体的稳定性与基因转录。通过主动分泌或者被动释放到细胞外后，胞外HMGB1成为脓毒血症和无菌性炎症的晚期炎症介质，同时可以作为免疫细胞的趋化因子刺激树突状细胞的成熟和迁移[7]。在肝肾非移植IRI的小鼠模型中，HMGB1的水平在损伤器官中有明显的上升，当用药物阻断HMGB1时会减轻器官的炎症反应[8,9]。2014年Zhang等[10]发现在同系小鼠的心脏移植模型中，通过对细胞凋亡进行抑制，移植物中的Hmgb1基因表达减少，当使用外源性重组HMGB1时，会使移植物中的促炎细胞因子IL-17表达增加。和该研究一致，另外一项研究也证实低温保存大鼠的移植心脏会使移植后移植物中的Hmgb1基因表达增加，同时IRI会导致HMGB1从移植物中释放[11]。在MHC全错配的小鼠心脏移植模型中,药物阻断HMGB1的活性会使心脏移植物的炎症减轻、存活时间延长1周[12]。这些发现均表明HMGB1参与了器官移植中的急性排斥反应，不仅如此，HMGB1同样参与了慢性排斥反应。在MHCⅡ错配的小鼠心脏慢性排斥反应模型中，移植心脏HMGB1的水平在移植后2个月上升，同时在移植后第1个月每4 d使用1次抗HMGB1单抗会使移植物血管病变减少50%，同时减少的还有移植物中IL-17A、IFN-γ以及炎性巨噬细胞[13]。

1.2热休克蛋白家族(Heat-shock proteins ，HSPs) 在正常细胞中，HSPs是一种分子伴侣，通过阻止肽链的聚合及错误折叠来指导其合成。在细胞应激条件下，HSPs的诱导和分泌会使促炎细胞因子及趋化因子释放和活化，促使抗原递呈细胞(APC)成熟进而引起强烈的先天性免疫反应[14]。HSPs通过连接和提呈抗原给MHCⅠ类分子进而激活T细胞，扩大了其作为细胞内分子伴侣的作用，APC占据细胞外HSPs及抗原，通过交叉递呈的方式激活T细胞[15]，在小鼠肾移植的急慢性期均观察到HSPs增加[16]，但是在小鼠皮肤移植模型中，在供者Hsp1b基因缺失及供受者Hsp1a基因均缺失的条件下均不会影响移植排斥发生的时间[17]，同时在2016年Mirza等[18]发现可溶性HSPs家族成员并未参与移植物抗宿主病，其表达仅仅与患者是否使用抗胸腺细胞球蛋白相关，因此就目前研究情况来看HSPs在器官移植中表达需要更进一步的研究。

1.3S100蛋白家族 S100蛋白家族是钙结合蛋白大家族中的一员，因其在中性饱和硫酸铵中100%的溶解率而得名。目前至少发现了20种S100蛋白，其在细胞内可调节蛋白质磷酸化、酶的活性、钙离子的稳态等。当从巨噬细胞及其他细胞中释放到细胞外后作为DAMPs发挥功能，像HMGB1一样发挥早期促炎效应[19]。通过检测限制性移植物综合征及细支气管闭塞综合征的肺移植受者支气管肺泡灌洗液发现，S100蛋白家族(包括S100A8、S100A9、S100A8/A9、S100A12 和S100P)在移植物功能不稳定患者中有上升趋势[20]。相反，肾移植中S100A8、S100A9的表达和慢性移植物血管病变的下降相关，在肾移植急性期进行的肾活检标本中，高水平的S100A8、S100A9预示着更好的移植肾远期结果，那些进展为慢性移植肾肾病的患者有着更低水平的S100A8、S100A9[21]，另外一项研究也证实在人肾移植中S100A8会使移植物炎症减轻[22]，S100蛋白在肾移植和肺移植中表现出的不同特点也许和两种移植方式不同有关，例如移植肺和周围空气直接接触而移植肾不直接接触外界环境。众所周知，器官移植的患者由于长久患病及服用免疫抑制剂，会导致免疫功能低下，患者极易患上诸如曲霉菌感染等机会性感染。Dix等[23]人通过基因组表达谱分析发现S100B是曲霉菌感染的潜在生物标记物，然而目前并无研究证明在器官移植中究竟是机会性感染导致S100蛋白家族成员的变化，还是免疫功能低下独立作用于机会性感染和S100蛋白家族成员。

1.4结合珠蛋白(Haptoglobin) 结合珠蛋白有结合血红素及抗氧化活性，运用蛋白组学方法发现其在同基因及异基因小鼠皮肤移植中均有上升[24]。在移植后头2周，结合珠蛋白会刺激移植物内树突状细胞的聚集，增加促炎因子IL-6及中性粒细胞趋化因子CXCL2(也被称作MIP2)的表达，减少免疫抑制因子IL-10的水平，加剧移植物内的炎症。发生细胞排斥反应的人移植心脏的活检标本中也发现了结合珠蛋白的上升[25]。一项研究通过分析肾移植患者尿蛋白，发现发生急性排斥反应的患者尿中结合珠蛋白会出现明显的峰值[26]。在肝移植并发一过性淋巴细胞综合征的患者中观察到结合珠蛋白的下降，但是此种情况大多数发生于移植ABO血型不相容的情况下，有可能与溶血相关[27]。

1.5透明质酸(Hyaluronic acid,HA) 透明质酸是细胞外基质蛋白聚糖成分之一，其和各种无菌性炎症的实验室模型相关，最典型的模型是小鼠博来霉素诱导的肺损伤及非移植缺血再灌注损伤模型，在静止非炎症状态下其以大分子形式存在，当炎症状态下其会降解成小片段，一项研究表明这些小片段会激活Toll样受体(一种先天性免疫反应受体)来诱导炎症[28]，另外一项研究表明大分子形式透明质酸会促进CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制效应[29]。在发生急性排斥反应的人移植肾以及发生慢性排斥反应的移植肺中，均发现了透明质酸水平增加[30,31]，而且透明质酸片段可以破坏已经建立起来的免疫耐受[31],在肝移植患者中,术前血清中高水平的透明质酸提示较低的五年生存率,同时其与术后高水平胆红素和腹水相关[32]。

1.6Tamm-Horsfall蛋白(THP) Tamm-Horsfall蛋白(THP)分布在肾脏髓攀升支粗段及远端小管的上皮细胞内，是尿中含量最丰富的蛋白质，各种原因造成的肾损伤均可导致THP排出量发生变化，与各种慢性肾脏疾病及肾脏先天免疫有关[33]，它可以作为肾小管损伤的一种信号分子，可以促进细胞因子的释放及免疫细胞活化，但THP同时也具有保护性抗炎作用，一项对比肾移植患者与正常人THP的研究发现，肾移植患者的THP结合补体C1q、TNF-α的能力地下降，同时其刺激单核细胞增殖及中性粒细胞吞噬能力也下降，尤为显著的是肾移植患者的THP对单核细胞及中性粒细胞有强大的凋亡诱导能力[34]。与此一致的是，2008年一项对急性缺血性肾损伤的研究发现，THP通过稳定外髓部的环境对肾缺血性损伤有保护作用[35]。

1.7其他DAMPs 导致无菌性炎症的DAMPs还有很多，比如腺苷、半乳凝集素、IL-33、IL-1α等,IL-1α从坏死细胞中释放出来会发生无菌性炎症及增强随之而来的获得性免疫反应，诱导间皮细胞释放中性粒细胞趋化因子[36]，把人的冠状动脉移植到用人外周血单个核细胞重组的免疫缺陷小鼠中也证实了IL-1α增强了无菌性炎症之后的获得性免疫反应，该实验中冠状动脉的内皮细胞中出现了IL-1α，通过抑制IL-1α减轻了移植物中的T细胞浸润[37]。腺苷、半乳凝集素、IL-33等在器官移植中的作用目前还没有明确的报道[38]，另外一些导致无菌性炎症的DAMPs比如尿酸、线粒体DNA等目前则不认为是器官移植后发生无菌性炎症的原因[4]。

2 相关受体及信号传导通路

引起先天性免疫的模式识别受体主要分为四类：Toll样受体、DOD样受体、维甲酸诱导基因1样受体、C型凝集素受体[39]。器官移植中引起无菌性炎症的先天性受体主要为：Toll样受体、炎性体(NOD样受体)。维甲酸诱导基因1样受体、C型凝集素受体目前在器官移植中还未得到验证[4]。另外一些只针对DAMPs而不针对PAMPs的受体在器官移植中也发挥了重要作用，比如RAGE。

2.1Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)及信号传导通路 TLR是经典的先天性免疫受体，其作为一种高度保守的跨膜PRRs识别DAMPs及PAMPs，相当于免疫系统哨兵来识别非我分子，进而产生细胞应激和组织损伤。TLRs的N端由富含亮氨酸重复序列的结构域组成，其可以结合配体；中间为跨膜结构域；胞浆内为Toll/IL-1受体同源结构域。目前发现的人类TLR约有10多种，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR11跨细胞膜，因此能对细胞外的配体产生反应；TLR3 和TLRs7-10跨细胞内溶酶体膜，因此可对被溶酶体处理的损伤细胞及外源性有机体的核酸产生反应[39]。

TLR在许多类型的细胞中表达和发挥功能，特别是先天性免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞。其可与在器官移植中产生的众多DAMPs产生反应，包括HMGB1、S100、HSPs、HA、THP。在许多人类及动物试验中均观察到TLRs的水平在IRI及排斥反应的过程中上调[40]。内源性配体与TLRs结合后，常常会导致TLR的异源二聚化，导致细胞内信号分子的级联反应，促炎细胞因子及趋化因子的产生。TLR信号通常会有共同的下游信号分子MYD88，但TLR3例外，TLR3的活化由TICAM1的募集所介导。TLR4信号则会把MYD88及TICAM1均激活。MYD88的信号通路导致NF-κβ从细胞浆到细胞核的转位诱导促炎因子及趋化因子的产生，TLR/MYD88/NF-κβ通路同时会导致两种促炎细胞因子前体pro-IL1β和pro-IL18的转录以及炎性体的合成，该炎性体在器官移植的无菌性炎症中也有重要作用。TLR/TICAM通路则会导致IFN-α和IFN-β的产生[39]。

在小鼠IRI损伤模型中,MydD88或者Tlr4基因缺陷表现出了对肾脏失功、组织损伤及炎症反应的保护作用[40]。另外一项研究却发现只有Tlr4基因对肾脏IRI的诱导具有关键性作用，MydD88基因及Ticam1基因没有表现出这种作用，目前MydD88基因和Ticam1基因在肾脏IRI中的协同作用还没有在双基因Ticam1/MydD88缺陷的小鼠中进行验证[41]。在心脏移植急性排斥反应中先天性免疫反应是必不可少的，肾脏IRI需要TLR，因此阻断TLR信号通路可以阻止急性排斥反应。MydD88基因缺失联合共刺激阻断会诱导皮肤移植免疫耐受[42]，通过小干涉RNA下调MydD88 和Ticam1基因会把心脏移植物的存活时间延长到40 d[43]。小鼠肾移植模型中，MydD88基因缺陷的小鼠比野生型小鼠的移植物存活时间更长(分为100 d、40 d)，在最容易发生急性排斥反应的移植后14 d，MyD88基因缺陷小鼠更不容易发生急性排斥反应及移植物炎症，在移植后100 d,MydD88基因缺陷小鼠的肾功能及慢性排斥反应发生都要好于野生型[44]。这些实验均表明MYD88在急慢性排斥反应中有重要作用，其阻止了移植耐受的诱导，同时阻断TLR通路可以减少排斥反应的发生，延长移植物存活时间。

2.2NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性体及相关信号通路 NLRP3(NLR pyrin domain containing 3)炎性体是目前研究最全面的炎性体，它是NOD样受体(Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors，NOD-like receptor,NLRs)家族成员之一,NLRs属于细胞质内的一种PRRs,连接先天性免疫与获得性免疫反应，是炎症反应的关键性分子通路。其由三部分组成：①N端热蛋白结构域(Pyrin domain，PYD)，能够结合下游蛋白；②位于中间的核苷酸结合寡聚化区域(Nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD)；③C端富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat，LRR)，识别DAMP或者PAMP。

NLRP3炎性体是以NLRP3为骨架形成的一种细胞内多蛋白复合体，也包括三部分：NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1)[45]。NLRP3炎性体识别DAMPs后，通过NLRP3/ASC/caspase-1信号传导通路激活下游分子IL-1β前体、IL-18前体，进而生成成熟的IL-1β、IL-18产生一系列炎症反应。越来越多的证据表明器官移植之后会发生炎性体的活化。异基因小鼠心脏移植中，心肌间质的ASC及IL-1β发生上调，其程度与排斥反应的程度一致，但是在同基因小鼠中ASC及IL-1β水平较低[46]。2015年的一项研究明确了发生排斥反应的人心脏移植物标本中也有ASC的表达[47]。分析肺移植患者的支气管肺泡灌洗液发现NLRP3、IL-1β、caspase-1均有上升，但该研究并未对移植结果有重要影响的蛋白修饰进行分析，比如caspase-1[48]。以上研究均发现NLRP3炎性体在器官移植中有明确的变化，但其主要配体却未见明确阐述。目前认为器官移植中IRI损伤产生的DAMPs,包括：ATP、反应性氧产物、透明质酸等都可以成为NLRP3的配体，炎性体与这些配体相互作用的分子机制及生物学作用有待进一步研究。

2.3晚期糖基化终末产物受体 (Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)及其信号通路 RAGE在1992年由Neeper首次发现并命名，其可以识别并结合晚期糖基化终末产物(AGE)[49]。它是免疫球蛋白超家族成员，在多种细胞(血管内皮细胞、心肌细胞、免疫细胞)表面呈低水平表达，一旦发生炎症或出现RAGE配体时，其表达水平即可上升。RAGE是一种多配体受体除了可以结合AGE外，还可以结合S100、HMGB1、淀粉样蛋白。一旦结合内源性配体，其下游细胞分子、黏附分子、NF-κβ激活,引发一系列炎症级联反应。许多无菌性炎症的受体不仅可以对病原体产生反应而且可以对内源性物质产生反应，而RAGE是例外，目前发现其不会对病原体产生反应[5]。

RAGE的可溶性形式sRAGE,可以作为一种欺骗性的受体结合HMGB1和其他配体,抑制免疫反应，在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病中发挥重要作用[50]。在成人及大鼠肾移植中观察到RGE/RAGE/ILK通路促进动脉粥样硬化的形成，很有可能是通过诱导血管平滑肌细胞向成骨细胞转化而实现的[51]。同时sRAGE还可以降低HMGB1的生物利用度[52]，在小鼠心脏缺血再灌注损伤模型中，HGMB1表达显著升高 ，其与RAGE结合后促进巨噬细胞炎症反应[53]，在另一项心脏缺血再灌注的试验中，大鼠缺血心脏的RAGE及其配体均明显上升，用sRAGE对大鼠进行预处理之后，心肌缺血损伤、功能恢复均得到改善，纯合子RAGE缺陷小鼠的心肌LDH释放减少，功能恢复改善，提示RAGE缺陷对IRI有保护作用[54]。心脏移植的小鼠实验发现阻断RAGE后，中位生存期可以延长到3周，而对照组的中位生存期只有1周[55]。心肌IRI中，Rage-/-小鼠心肌细胞LDH释放明显减少，同时JNK激活下降 ，而GSK-3β磷酸化增加，提示RAGE可能通过JNK的激活和GSK-3β的去磷酸化参与缺血再灌注导致的心肌细胞损伤[56]。目前在器官移植中RAGE通路中的分子及缺血再灌注损伤诱导的分子级联反应仍然需要更进一步的研究以及需要更多实验的支持。

2.4其他受体及信号通路 除了在器官移植中诱导无菌性炎症及先天性免疫外，另外一些受体及通路可以区分DAMP及PAMP,抑制DAMP的信号，阻止无限度的炎症反应和过度的组织损害。比如CD24-Siglec(Sialic acid binding Ig-like lectins)通路，可以负性调节TLR及NLR介导的针对HMGB1及热休克蛋白的免疫反应[57]。在小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型中，使用HMGB1预处理可以降低肾脏组织损害、炎症反应，产生保护肾脏的作用，防止肾脏失功，进一步分析发现，HMGB1预处理使Siglec发生上调[58]。还有一些诱发无菌性炎症的受体和急性排斥反应相关，比如IL-1受体(IL-1R)，IL-1α会诱导移植物中T细胞浸润，IL-1R2控制着IL-1α的释放、阻止IL-1α裂解，而且诱导坏死后炎症的细胞要么不表达IL-1R2，要么出现caspase-1活化(caspase-1会废除IL-1R2的效应)[59]。器官移植中的SPAMPs、受体通路、相关疾病详见表1。

3 展望及未来

目前对器官移植的关注更多的是放在获得性免疫的细胞免疫及体液免疫中，对先天性免疫的关注甚少，器官移植中IRI是一个不可避免的过程，早期产生的DAMPs诱发无菌性炎症，激活先天性免疫系统，其在连接先天性免疫反应和获得性免疫反应中有重要作用，其受体及相关通路的机制还需进一步研究，深入研究它们之间的关系，发现更多的DAMPs,明确器官移植后炎症诱导机制有助于提供新的治疗靶点，对监测移植物功能有重要意义。

表1器官移植中DAMPs、受体通路、相关疾病

Tab.1DAMPs，receptorpathwayandrelateddiseasesinorgantransplantation

DAMPs受体通路相关疾病HMGB1TLR2/4、RAGE、CD24启动无菌性炎症、IRI、排斥反应、防止过度炎症反应、区分DAMPs及PAMPs[10-13,52,56]S100RAGE、TLR4肺移植中加剧炎症及排斥反应;肾移植中缓解炎症减轻移植物血管病变[20-22]HSPTLR2/4移植炎症及排斥反应发生的时间[15,16]HATLRs、CD44、NLRP3纤维化、加剧炎症、促进Treg功能、破坏移植耐受[29-31]THPTLR4诱导移植物炎症、保护性抗炎、稳定移植肾外髓部环境[35]IL-1IL-1R诱导T细胞浸润、急性排斥反应[58]HaptoglobinTLRs加剧移植器官局部炎症[25]

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[收稿2017-02-21 修回2017-03-29]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.034

R392.11

A

1000-484X(2017)11-1755-06

曹 溆(1986年-), 男，在读硕士，主要从事肾脏肿瘤的基础及临床方面研究，E-mail：acaoxu@126.com。

及指导教师：张克勤(1965年-)，男，博士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事移植免疫学方面的研究，E-mail:zhkq2000@sina.com。