脊髓康对共培养体系中小胶质细胞吞噬及损伤神经元再生的影响①

潘娅岚 郭 杨 周龙云 苑文超 马 勇 黄桂成

(南京中医药大学骨伤研究所，南京 210029)

·中医中药与免疫·

脊髓康对共培养体系中小胶质细胞吞噬及损伤神经元再生的影响①

潘娅岚 郭 杨②③周龙云 苑文超 马 勇②黄桂成②

(南京中医药大学骨伤研究所，南京 210029)

目的观察中药复方脊髓康对共培养体系中小胶质细胞吞噬及损伤神经元修复再生的影响。方法制备脊髓康含药血清，分离、鉴定原代海马神经元、原代小胶质细胞，谷氨酸诱导神经元损伤，含药血清预处理小胶质细胞，建立小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，采用免疫荧光双重标记法观察混培养24 h后小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用及96 h后损伤神经元突起生长情况。结果混合培养24 h后，脊髓康含药血清中、高剂量组在吞噬指数及吞噬百分率方面均高于空白组(P<0.05)，中剂量组低于脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组(P<0.05)，高剂量组与LPS组间的差异则无统计学意义(P>0.05)。混合培养96 h后，脊髓康含药血清中、高剂量组一级突起数量多于空白组(P<0.05)，与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。脊髓康中、高剂量组平均突起较空白组长(P<0.05)，与LPS对比，脊髓康中剂量组平均神经突起较短(P<0.05)，而高剂量组则平均突起较长(P<0.05)。结论中药复方脊髓康可能通过促进小胶质细胞吞噬神经元碎片，改善局部微环境，从而促进损伤神经元的修复再生。

中药复方；脊髓康；原代小胶质细胞；原代神经元；共培养；吞噬作用；神经元修复再生

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是脊柱疾病和脊柱损伤的严重并发症，多发于中青年[1]。流行病学调查显示，我国SCI发病率呈逐年上升趋势[2]。SCI后自身神经元的再生能力有限，一旦损伤难以修复，因而成为骨科及神经科学领域的研究热点和难点。小胶质细胞是中枢神经系统中的固有免疫细胞，其调控免疫应答、吞噬细胞碎片作用在神经生理病理性变化中意义重大[3,4]。目前，中医药对小胶质细胞吞噬作用的研究较少，基于此，本研究旨在观察SCI有效组方脊髓康[5-7]对小胶质细胞吞噬作用的影响，并探讨该影响与神经修复再生的相关性，拟为中医药治疗SCI提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SD雄性大鼠20只，8周龄，体重(190±10)g；孕18 d SD母鼠1只，新生1～2 d SD大鼠5只。动物均由南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK(苏)2014-0001。

1.1.1实验药物 脊髓康(生黄芪30 g，当归12 g，丹参20 g，地鳖虫10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，制大黄10 g等)为马勇教授临床经验方(国家发明专利ZL200910026193.7) ，其生药由南京中医药大学附属医院提供。

1.1.2仪器与试剂 倒置荧光显微镜(Leica，德国)；体视显微镜(Olympus，日本)；DMEM高糖、DMEM/F12培养基、FBS、B27、0.25胰酶(含EDTA) (Thermofisher,美国)；L-谷氨酰胺、脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS)、多聚赖氨酸(Sigma,美国)；凋亡试剂盒(Roche,瑞士)；CD11b 小鼠抗大鼠多克隆抗体(CBL1512,Milipore,美国)；β III Tubulin兔抗鼠单克隆抗体(#5568,CST,美国)；Alexa 594羊抗兔、Alexa 488羊抗小鼠(SA00006-4,SA00006-1,武汉三鹰)。

1.2实验方法

1.2.1含药血清制备 脊髓康原方，加10倍水量，常规煎煮，滤液浓缩至2 g生药/ml，4℃保存备用。健康SD雄性大鼠随机分为空白组和给药组。给药组以生药量20 g/kg灌胃，连续给药3 d，空白组给予等量生理盐水。末次给药后1 h腹主动脉采血，37℃静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取上清，56℃水浴30 min灭活补体，0.22 μmol/L的微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

1.2.2原代细胞分离、培养

1.2.2.1原代小胶质细胞分离、培养 参考相关文献所述方法[8,9]，取新生SD大鼠，逐一经75%酒精消毒30 s，断头完整取出大脑及脑干；体视显微镜下，剥离血管膜，去除脑干及海马，剪碎脑皮质，暂存于0℃DMEM高糖+10%FBS培养基中；取剪碎脑皮质，离心去上清，加入0.125%胰酶5 ml重悬，移入10 cm培养皿，于CO2培养箱中消化15 min；加入1 ml 血清终止消化，加入2 ml全培缓慢吹打，静置后吸取上清；2 000 r/min离心2 min，移去上清，以DMEM/F12+10%FBS培养基重悬；细胞计数后，以2.5×105个细胞/ml密度接种于包被赖氨酸的6孔板中，置于CO2培养箱中孵育；4 h及24 h后更换DMEM/F12+10%FBS培养基，之后每2～3 d更换一次培养液。细胞培养15 d后，吸取原培养基并保留，以DMEM/F12洗涤1 min后吸除，每孔加入DMEM/F12稀释的0.062 5%胰酶2 ml，于37℃ CO2培养箱中孵育25～40 min，每孔加入DMEM/F12+10%FBS 2 ml终止消化；小心吸去未贴壁细胞，以DMEM/F12+10%FBS新鲜培养基与上述保留混合胶质细胞培养基1∶1混合，每孔加入2 ml继续培养，培养1～2 d后行鉴定及进行实验。

1.2.2.2原代神经元分离、培养 取孕期18 d母鼠，戊巴比妥钠麻醉，剖腹取出子宫，剥离取出胎盘，迅速分离所有胎鼠大脑及脑干，暂存于0℃ DMEM/F12+10%FBS培养基中；体视显微镜下，暴露海马体，剥离血管膜，剪碎海马体，暂存于0℃ DMEM/F12+10%FBS培养基；取剪碎海马体，移入10 cm培养皿，5 ml针筒吹打组织混悬液20次，经40 μm细胞筛过滤；2 000 r/min离心2 min，移去上清，加入DMEM/F12+10%FBS+B27重悬；计数细胞，以2×105个细胞/ml密度接种于包被赖氨酸的24孔板中，置37℃ CO2培养箱中孵育；4 h后更换DMEM/F12+10%FBS+B27培养基，加入10 μmol/L阿糖胞苷干预24 h，次日更换培养基，继续孵育，培养7～12 d神经元行鉴定及后续实验。

1.2.3神经元损伤模型的建立 取培养神经元，随机分为正常组及模型组。吸去原培养基，以PBS洗涤3次，正常组加入DMEM/F12继续培养，模型组加入含100 μmol/L谷氨酸DMEM/F12干预30 min，30 min后两组吸去培养基，以PBS洗涤3次，换DMEM/F12+10%FBS+B27培养基继续培养，24 h后神经元凋亡模型经AnnexinV-FITC/PI双染流式检测鉴定。

1.2.4实验分组 脊髓康含药血清分为2.5%(低)、5%(中)、10%(高)含药血清组，同时设置10%空白血清组、1 μg/ml LPS+10%空白血清组(阳性对照组)[10,11]。2.5%、5%含药血清组用空白血清稀释，临用时将各组血清加入DMEM/F12培养液中，并使培养液中血清终浓度为10%。

1.2.5小胶质细胞/损伤神经元共培养体系 参考相关文献所述方法[12,13]，取培养10 d神经元，每孔加入100 μmol/L谷氨酸DMEM/F12干预30 min，换DMEM/F12+10%FBS+B27培养基继续培养24 h。回收原代培养小胶质细胞，以DMEM/F12+B27调整细胞密度为2×105个细胞/ml，配置2.5%、5%、10%含药血清、10%空白血清及1 μg/ml LPS+10%空白血清细胞悬液，每孔500 μl接种于赖氨酸包被的24孔板内过夜。次日，回收谷氨酸诱导的损伤神经元，每孔加入100 μl 0.25%胰酶，10 s后吸去胰酶，1～2 min后加入1 ml DMEM/F12+10%FBS终止消化，并轻匀吹打，回收、离心、重悬，以DMEM/F12+10%FBS+B27调整细胞密度为2×104个细胞/ml；吸除接种小胶质细胞板内培养基，PBS洗涤3次，每孔500 μl接种神经元细胞混悬液与小胶质细胞混合培养，每组6个平行孔。

1.2.6细胞免疫荧光化学染色 小胶质细胞/损伤神经元混合培养24 h后，每组取3个平行孔，吸去培养基，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定10 min，0.2%Triton-100通透10 min,PBS洗涤；1.5%山羊血清的PBS室温封闭60 min；分别加入一抗：兔抗β3-tubulin结合神经元骨架、小鼠抗CD11b(1∶200)结合小胶质细胞相关膜蛋白，4℃过夜；PBS洗涤细胞3次，加入二抗Alexa 594羊抗兔、Alexa 488羊抗小鼠，室温避光孵育2 h；PBS洗涤细胞3次，于倒置荧光显微镜下观察。200倍镜下每组随机选取6个视野，计数视野下小胶质细胞数(N)，吞噬碎片小胶质细胞数(n)，被吞噬碎片数(m)，计算吞噬百分率(n/N)、吞噬指数(m/N)，摄取图像时以PBS洗涤或晃动培养板以观察神经元碎片是否移动，确保碎片在小胶质细胞胞内。

小胶质细胞/损伤神经元混合培养96 h后，按上述方法孵育一抗β3-tubulin、二抗Alexa 594，Dapi复染。每组随机选取15个神经元，记录每个神经元一级突起(从胞体直接发出的突起的)数量，运用Image-Pro Plus 6.0曲线测量功能，测量并计算每个神经元一级突起平均长度。

1.2.7流式细胞仪检测凋亡率 谷氨酸造模后24 h，胰酶消化以EP管回收神经元，细胞计数使每管细胞量在0.5×105～5×105个；200 g离心5 min，PBS漂洗，再次重复离心2次；每1ml结合缓冲液加入20 μl AnnexinV-FITC及20 μl PI染色试剂，轻轻混匀；每EP管加入100 μl AnnexinV-FITC/PI染色混合液，避光孵育10～15 min，设置不加AnnexinV-FITC及PI的样本为阴性对照，单加AnnexinV-FITC及PI的样本做调节补偿。每样本加入800 μl PBS上机检测。

2 结果

2.1原代细胞分离、培养 18 d龄胎鼠分离、培养的神经元及新生鼠分离、纯化的小胶质细胞，见图1。

2.2原代细胞的鉴定 神经元经β III Tubulin特异性染色、小胶质细胞经CD11b特异性染色，结果示两种原代细胞纯度≥95%，见图2。

2.3神经元损伤模型的鉴定 AnnexinV-FITC/PI双染经流式检测显示：正常组神经元凋亡率为(2.5±2.9)%，模型组神经元凋亡率为(23.9±2.5)%，模型组神经元凋亡率明显高于正常组(P<0.05)，提示谷氨酸诱导神经元损伤模型的成功建立，见图3。

2.4脊髓康对小胶质细胞神经元碎片吞噬作用的影响 共培养后24 h，以一抗β3-tubulin、二抗Alexa 594标记神经元骨架及碎片，以一抗CD11b、二抗Alexa 488标记小胶质细胞相关膜蛋白，观察小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用，经PBS洗涤或晃动培养板，所观察到的与小胶质细胞重叠的神经元碎片均未出现明显移位。结果显示：脊髓康含药血清中、高剂量组在吞噬指数及吞噬百分率方面均高于空白组(P<0.05)，中剂量组低于LPS组(P<0.05)，高剂量组与LPS组间差异则无统计学意义(P>0.05)。见图4、5。

图1 原代细胞的分离培养 Fig.1 Isolation and culture of primary cellsNote: A.SD rat of pregnant 18 d;B.Neurons cultured for 10 d;C.Purified primary microglia.scale bar 50 μm.

图3 Annexin V-FITC/PI双染流式检测细胞凋亡Fig.3 Flow cytometry detecting cell apoptosis by Annexin V-FITC/OI staining

图4 观察脊髓康对小胶质细胞吞噬神经元碎片的影响Fig.4 Effect of Jisuikang on phagocytosing neuron debris by microgliaNote: A.Control;B.Low dose of Jisuikang；C.Middle dose of Jisuikang;D.High dose of Jisuikang;E.LPS.Scale bar：20 μm.

图5 各组小胶质细胞吞噬百分率、吞噬指数比较Fig.5 Phagocytosis percentage and index of microglia in each groupNote: JSK-L.Low dose of Jisuikang;JSK-M.Middle dose of Jisuikang;JSK-H.High dose of Jisuikang.Compared with control,**.P<0.01;compared with LPS,##.P<0.01.

2.5脊髓康对小胶质细胞/损伤神经元混培养体系存活神经元生长的影响 共培养96 h后，观察存活神经元生长情况。结果显示：脊髓康含药血清中、高剂量组一级突起数量多于空白组，与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。脊髓康提高了神经元平均突起长度，与LPS对比，脊髓康中剂量组平均神经突起较短，而高剂量组则平均突起较长，见图6、7。

图6 存活神经元的生长情况Fig.6 Growth of surviving neuronsNote: A.Control;B.Low dose of Jisuikang；C.Middle dose of Jisuikang;D.High dose of Jisuikang;E.LPS.Scale bar：20 μm.

图7 各组存活神经元的一级突起数量及平均长度对比Fig.7 Number and average length of primary neurites of each surviving neuron in each groupNote: JSK-L.Low dose of Jisuikang;JSK-M.Middle dose of Jisuikang;JSK-H.High dose of Jisuikang.compared with control，**.P<0.01;compared with LPS，#.P<0.05,##.P<0.01.

3 讨论

小胶质细胞是机体重要的固有免疫细胞，其数量约占中枢神经系统细胞总数的10%。当SCI发生时，小胶质细胞被迅速激活，介导多种免疫应答，发挥清道夫样作用，对疾病的发生、发展及恢复有着重要意义[4,14-17]。目前，中医药调控小胶质细胞治疗SCI的研究较少，已有研究表明部分中药能够抑制小胶质细胞过度激活所致的免疫炎性反应，从而起到保护神经的作用[18,19]，但中药对小胶质细胞吞噬作用的影响，以及该影响与神经修复间的关系依旧是片盲区。

LPS是激活小胶质细胞，促进其吞噬功能的有效化学试剂[20,21]。目前，提取、纯化原代神经元、小胶质细胞尚存在一定难度，但鉴于细胞株与原代细胞功能等方面的一些差别，本实验前提条件仍设定以原代细胞进行研究。实验过程中，对提取的原代小胶质细胞及神经元损伤模型均行鉴定，确保了实验前提的可靠性。中枢神经系统是一个由多种胶质细胞及神经元构成的复杂体系，SCI的发生亦并非是单一系统或某一细胞群的病变。因此，建立一个多因素、立体式复杂混合体系，模拟中枢神经系统的构成，应是SCI体外研究的潜在方向所在。但目前，中医药干预神经细胞共培养体系的研究甚少，本研究则立于中医学“整体观”核心理念，初步建立了一个简单的、模拟整体的神经细胞混合体系。本次研究数据显示，共培养24 h后，脊髓康组随着含药血清浓度的升高，吞噬指数及吞噬百分率呈依次上升趋势，其中脊髓康中、高剂量组在上述两方面均高于空白组，脊髓康高剂量组与LPS组对比则并无显著差异，提示脊髓康能提高小胶质细胞的吞噬功能，且存在一定的量效关系。共培养96 h后，LPS组存活神经元平均突起较空白组长，研究表明，小胶质细胞的清道夫样作用可通过清除凋亡神经元，减少毒性物质、细胞因子等释放，进而抑制SCI后过度的免疫炎性反应，以利于损伤神经元的修复再生[22,23]。故本实验中，LPS可能通过促进小胶质细胞吞噬神经元碎片作用，改善局部微环境，促进存活神经元的修复再生，这与之前报道的研究结果有着一致性[13]。脊髓康含药血清低、中、高剂量组，在提高小胶质细胞吞噬功能同时，亦观察到了其促进存活神经元生长的现象，且其与小胶质细胞吞噬功能的高低有着一定相关性。鉴于本实验采用的是含药血清预处理小胶质细胞的方法，混培养体系并无含药血清的存在，我们认为，含药血清并不是本实验中促进存活神经元生长的直接因素，而与LPS有着类似之处，即中药复方脊髓康可能通过促进小胶质细胞清理神经毒性物质，改善局部微环境，从而促进存活神经元的再生长。据实验结果，我们发现存活神经元的再生长与小胶质细胞的吞噬功能并不呈完全的正相关，LPS组小胶质细胞吞噬功能与脊髓康高剂量组无明显差异，且其在吞噬指数及吞噬百分率方面平均值均高于后者，但存活神经元的平均突起短于脊髓康高剂量组，这可能与LPS激活小胶质细胞后，其同样释放系列促炎因子相关。

《难经·二十八难》：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑”[24]，吴以岭指出：“督脉，其循行路线恰在脊髓与脑，督脉虚损，奇阳虚乏，不仅统率、督促全身阳气的作用减弱，其循行部位受累尤甚，脊髓失于温养而发病，与现代医学 SCI 发病位置及机制极为吻合”。因此，督脉反映或代表了脊髓的部分或绝大部分功能，而督脉病证大多是脊髓和脑的病证。但督脉绝不是孤立存在的，督脉的物质基础是肾所藏之精，它的能量产生是靠肾精化生的，如《临证指南医案·调经》：“八脉隶乎肝肾”[25]。鉴于督脉、肾精在 SCI 及修复中的积极意义，我们结合多年的临床实践将 SCI的病机归纳为“肾督虚损，瘀阻督脉，枢机统率失职”，并筛选出具有“祛瘀通督，温肾利湿，调和气血”之功效的温肾通督方脊髓康。该方以生黄芪为君，大补元气，壮督通瘀，体内研究表明，黄芪能下调超氧化物歧化酶、丙二醛水平，抑制SCI后神经元凋亡，促进SCI后大鼠运动功能的恢复[26,27]。配以大黄、枳实、川芎、水蛭、蜈蚣之品行气活血，祛瘀生新，现代研究提示，大黄提取物能降低局部炎性因子、氧化活性物水平，保护血脊髓屏障，减少CNS损伤后神经元的继发凋亡[28,29]，川芎嗪能改善脊髓血流，抑制细胞凋亡，降低局部炎性因子水平，清除氧自由基，发挥着抗炎、抗凋亡、抗氧化以改善SCI损伤局部微环境的作用[27]。辅以温补肾阳之肉苁蓉、仙灵脾等温肾祛寒，又加厚朴、泽泻、车前子等利水化湿，全方体现着“温肾、通督”两大原则，共奏袪瘀通督，温肾利湿之效。前期基础研究及临床研究均提示该方对SCI有着良好的功效，在改善脊髓微环境，促进SCI后患者神经功能的恢复方面疗效显著[5-7]。本次研究则涉足中医药研究较少关注之处，基于小胶质吞噬作用角度探讨了脊髓康对神经的保护作用，从新的方向阐释了脊髓康温肾通督的科学内涵。

我们认为本次实验有一定创新之处，但亦存在一些缺陷：①本实验提取的原代细胞未对其进行常规功能的检测，未能确定其活力及是否保持细胞原有特性；②本实验采用的混合培养体系与中枢神经系统的复杂构成差异仍较大，小胶质细胞与神经元的比例不一；③本研究未进行通路机制研究，仍缺少一定证据。综上，脊髓康可能通过促进小胶质细胞吞噬神经元碎片作用，改善局部微环境，从而促进损伤神经元的修复再生，但其详细机制仍待进一步研究。

[1] Furlan JC,Sakakibara BM,Miller WC,etal.Global incidence and prevalence of traumatic spinal cord injury[J].Canadian J Neurolog Sci,2013,40(4):456-464.

[2] Wang HF,Yin ZS,Chen Y.Epidemiological features of traumatic spinal cord injury in Anhui province[J].Spinal Cord,2013,51(1):20-22.

[3] LeRoux LG,Bredow S,Grosshans D,etal.Molecular imaging detects impairment in the retrograde axonal transport mechanism after radiation-induced spinal cord injury[J].Mol Imaging Biol,2014,16(4):504-510.

[4] Jin X,Yamashita T.Microglia in central nervous system repair after injury[J].J Biochem,2016,159:491-496.

[5] Ma Y,Zhou JZ.Effect of Jisuikang on hemorheology and inflammatory factors in rats following spinal cord injury[J].Neural Regeneration Res,2008,3(11):1176-1180.

[6] 潘娅岚,马 勇,郭 杨,等.脊髓康对脊髓损伤大鼠脊髓组织结构及神经生长因子表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(15):144-149.

[7] Wang JW,Wu M,Huang GC.Effect of jisuikang on kinetic dysfunction in patients after spinal injury[J].Chin J Integr Med,2008,14(3):190-193.

[8] Saura J,Tusell JM,Serratosa J.High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization[J].Glia,2003,44(3):183-189.

[9] Jose S,Tan SW,Tong CK,etal.Isolation and characterization of primary microglia from post-natal murine brain tissues:a comparison of two methods[J].Cell Biol Int,2015 39(12):1355-1363.

[10] Shi L,Zhao F,Zhu F,etal.Traditional chinese medicine formula "Xiaofeng granules" suppressed gouty arthritis animal models and inhibited the proteoglycan degradation on chondrocytes induced by monosodium urate[J].Ethnopharmacol,2016,191:254-263.

[11] Jing GC,Zhang MR,Ji C,etal.Effect of Chinese herbal compound Naofucong on the inflammatory process induced by high glucose in BV-2 cells[J].Chin J Integr Med,2016 22(11):832-839.

[12] Hsieh CL,Koike M,Spusta SC,etal.A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia[J].J Neurochem,2009,109(4):1144-1156.

[13] Tanaka T,Ueno M,Yamashita T.Engulfment of axon debris by microglia requires p38 MAPK activity[J].J Biol Chem,2009,284(32):21626-21636.

[14] Kigerl KA,Gensel JC,Ankeny DP,etal.Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord[J].J Neurosci,2009,29(43):13435-13444.

[15] Koizumi S,Shigemoto-Mogami Y,Nasu-Tada K,etal.UDP acting at P2Y6 receptors is a mediator of microglial phagocytosis[J].Nature,2007,446(7139):1091-1095.

[16] 张青海，易光辉，李媛彬，等.B类1型清道夫受体表达调控与信号转导通路[J].中国生物化学与分子生物学报,2009(11):1003-1009.

[17] Fu H,Liu B,Frost JL,etal.Complement component C3 and complement receptor type 3 contribute to the phagocytosis and clearance of fibrillar Aβ by microglia[J].Glia,2012,60(6):993-1003.

[18] He Y,Du M,Gao Y,etal.Astragaloside IV attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis of mice by counteracting oxidative stress at multiple levels[J].PLoS One,2013,8(10):e76495.

[19] Ke L,Guo W,Xu J,etal.Ginsenoside Rb1 attenuates activated microglia-induced neuronal damage[J].Neural Regen Res,2014,9(3):252-259.

[20] Tremblay ME,Zhang I,Bisht K,etal.Remodeling of lipid bodies by docosahexaenoic acid in activated microglial cells[J].J Neuroinflammation,2016,13(1):116.

[21] Kata D,Földesi I,Feher LZ,etal.Rosuvastatin enhances anti-inflammatory and inhibits pro-inflammatory functions in cultured microglial cells[J].Neuroscience,2016,314:47-63.

[22] Hsieh CL,Koike M,Spusta SC,etal.A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia[J].Neurochem,2009,109(4):1144-1156.

[23] Ravichandran KS,Lorenz U.Engulfment of apoptotic cells:signals for a good meal[J].Nat Rev Immunol,2007(12),7:964-974.

[24] 秦越人.难经[M].北京:中国中医药出版社,1998:45.

[25] 叶天士.临证指南医案[M].北京:华夏出版社,1995:489.

[26] Li H,Shi R,Ding F,etal.Astragalus polysaccharide suppresses 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in caenorhabditis elegans[J].Oxid Med Cell Longev,2016,2016:4856761.

[27] Zhang Q,Yang H,An J,etal.Therapeutic effects of traditional chinese medicine on spinal cord injury:a promising supplementary treatment in future [J].Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016:8958721.

[28] Lu K,Zhang C,Wu W,etal.Rhubarb extract has a protective role against radiation-induced brain injury and neuronal cell apoptosis[J].Mol Med Rep,2015,12(2):2689-2694.

[29] Zhao Y,Fang Y,Li J,etal.Neuroprotective effects of Chrysophanol against inflammation in middle cerebral artery occlusion mices[J].Neurosci Lett,2016,630:16-22.

[收稿2017-03-15 修回2017-04-14]

(编辑 张晓舟)

EffectsofChineseherbalcompound"Jisuikang"onphagocytosisofmicrogliaandregenerationofinjuredneuronsinco-culturesystem

PANYa-Lan,GUOYang,ZHOULong-Yun,YUANWen-Chao,MAYong,HUANGGui-Cheng.

InstituteofOrthopedicsandTraumatologyofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029，China

Objective:To observe the effects of Chinese herbal compound 'Jisuikang' on the phagocytosis of microglia and the regeneration of injured neurons in co-culture system.MethodsPrepared drug serum of ‘Jisuikang′ and isolated and identified the primary neuron and microglia.The neuron cells were induced apoptosis by glutamic acid and the microglia cells were predisposed by drug serum of 'Jisuikang'.Then,the co-culture system of injured neurons and microglia cells was established.24 h and 96 h after co-culture,engulfment of neuron debris by microglia cells and regeneration of injured neurons were observed by immunofluorescence double labeling method.Results24 h after co-culture,middle and high dose of 'Jisuikang' showed greater phagocytic percentage and phagocytic index than that of control.In comparison of LPS,high dose of 'Jisuikang' showed no significant difference.96 h after co-culture,first grade of neuritis of middle and high dose of 'Jisuikang' were more than that of control,and there were no significant difference in comparison of LPS.Neuritis' mean length per cell of middle and high dose of 'Jisuikang' were larger than that of control.Neuritis' mean length per cell of high dose of 'Jisuikang' showed significant difference in comparison of LPS.ConclusionTraditional Chinese medicine compound 'Jisuikang' may enhance engulfment of neuron debris by microglia to improve local microenvironment,which promote the repair and regeneration of injured neurons.

Herbal compound;Jisuikang;Primary microglia;Primary neurons;Co-culture;Phagocytosis;Regeneration of neurons

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.011

①本文受国家自然科学基金青年项目(81704100)、国家自然科学基金面上项目(81573997)和江苏省高校自然科学研究面上项目(15KJD360001)资助。

②同时供职于南京中医药大学附属医院，南京 210029。

③通讯作者，E-mail：drguoyang@126.com。

R274.9

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1000-484X(2017)11-1652-06

潘娅岚(1989年-)，女，在读博士，主要从事医药治疗创伤与骨关节并的研究。