MR T2 mapping成像评估止痛健骨方治疗膝骨性关节炎关节软骨损伤疗效的实验研究

张 堃，朱克俭，谭旭仪，黄 刚，李 平，沈宏荣，朱 璐，马思静，朱 沛

(1.湖南中医药大学第一附属医院放射科，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；3.湖南省中医药研究院附属医院内科，4.骨伤科，6.药剂科，湖南 长沙 410006；5.湖南省人民医院超声科，湖南 长沙 410005)

MRT2mapping成像评估止痛健骨方治疗膝骨性关节炎关节软骨损伤疗效的实验研究

张 堃1,2，朱克俭2,3*，谭旭仪4，黄 刚4，李 平1，沈宏荣1，朱 璐5，马思静6，朱 沛6

(1.湖南中医药大学第一附属医院放射科，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；3.湖南省中医药研究院附属医院内科，4.骨伤科，6.药剂科，湖南 长沙 410006；5.湖南省人民医院超声科，湖南 长沙 410005)

目的探讨MR T2 mapping成像评价止痛健骨方治疗骨性关节炎软骨损伤疗效的价值。方法采用木瓜蛋白酶关节腔注射法制作新西兰大白兔膝骨关节炎模型，根据治疗方法不同将48只新西兰大白兔随机分为正常对照组、模型对照组、盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组。各组治疗4周后行膝关节MR T2 mapping成像并对关节软骨基质金属蛋白酶1(MMP-1)含量进行免疫组化分析。比较各组间关节软骨T2值及关节软骨MMP-1含量的差异，并分析不同干预方法、关节软骨MMP-1含量与关节软骨T2值的相关性。结果模型对照组关节软骨T2值高于其他3组(P均<0.01)，其他3组间关节软骨T2值差异无统计学意义。盐酸氨基葡萄糖治疗模型组、止痛健骨方治疗模型组间关节软骨MMP-1含量差异无统计学意义，但2组关节软骨的MMP-1含量低于模型对照组(P均<0.05)、高于正常对照组(P均<0.05)。关节软骨MMP-1含量与T2值间为非线性关系，随着前者的升高，后者先缓慢上升再快速上升(P<0.05)。结论MR T2 mapping成像有助于评价止痛健骨方治疗模型兔骨关节炎软骨损伤的疗效，关节软骨MMP-1含量与T2值间可能为非线性关系。

骨性关节炎；软骨；止痛健骨方；磁共振成像；T2图；基质金属蛋白酶1

骨性关节炎又称退行性骨关节病，属常见病，严重影响患者生活质量，并给社会带来沉重的经济负担[1]。关节软骨退变是骨性关节炎发生、发展的核心环节[2]，软骨基质金属蛋白酶1(matrix metalloprotease 1， MMP-1)在其中发挥了重要的作用[3]。止痛健骨方取自痰瘀同治、兼补肝肾之效验方，其对膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis， KOA)关节软骨损伤具有防治作用[4]。目前中西医KOA药物治疗疗效评估主要依靠病理、症状、X线等手段，存在有创、临床可操作性差、特异性低、主观性强等局限性，且在中医药领域表现的更为突出[5-6]。MR T2 mapping成像可无创、动态、准确地对关节软骨损伤程度进行定量评估[7]，在中药治疗KOA领域展现出了良好的应用前景及价值。本研究旨在探索MR T2 mapping成像用于评价止痛健骨方治疗KOA软骨损伤疗效的可行性，初步阐明定量T2值与关节软骨内MMP-1含量的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级新西兰健康成年大白兔48只，雌雄各半，月龄2～3个月，体质量1.40～2.46 kg，平均(2.00±0.21)kg，动物许可证号：SCXK(湘)2015-0008。

1.2 实验用药 止痛健骨方：当归12 g，白芥子(炒)12 g，丹参105 g，猪牙皂1.5 g，鹿角霜7.5 g，鳖甲7.5 g，黄芪9 g，乳香(醋制)7.5 g，没药(醋制)7.5 g，独活 3 g，千年健9 g，陆英9 g，共12味药。均从湖南省中医药研究院附属医院一次性购入，先水煎、再水浴浓缩至含止痛健骨方生药浓度为0.298 g/ml。盐酸氨基葡萄糖(四川新斯顿制药有限责任公司，批号:2015150612)。

1.3 兔KOA模型建立和分组 将48只兔随机分为4组，每组12只：正常对照组、模型对照组、盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组。其中后3组采用木瓜蛋白酶关节腔注射法造模[8]，在第1、4、7天，对兔右膝关节每天注射0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶溶液(Wellbio公司)1次。正常对照组兔右膝关节注射同剂量生理盐水。

适应性喂养1周后，于末次膝关节注射2周后开始接受不同的药物干预治疗，持续4周。止痛健骨方治疗组每天给予止痛健骨方，剂量为每天2.98 g/kg体质量；盐酸氨基葡萄糖治疗组接受盐酸氨基葡萄糖治疗，剂量为每天0.067 2 g/kg体质量(为临床等效剂量，依据人—兔等效剂量公式折算[9])。采用灌胃给药，给药容积为10 ml/kg体质量。正常对照组和模型对照组仅灌以相应容积的蒸馏水。所有动物单笼常规饲养，自由摄水，保持12 h昼夜轮替及恒温环境。

表1 各组关节软骨T2值及MMP-1含量比较[中位数(上下四分位数)]

1.4 MR检查及图像处理 灌胃治疗4周后对各组动物行MR扫描。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg体质量)经耳缘静脉注射麻醉动物后，仰卧位固定动物双膝，采用GE HDxT Signa 3.0T MRI系统、膝关节线圈，行兔右膝关节成像。扫描序列及参数：矢状位和冠状位脂肪抑制快速自旋回波质子加权序列，TR 1 500 ms，TE 30 ms，FOV 16 cm×16 cm，矩阵256×256，层厚 3 mm，层间隔0 mm；矢状位多回波自旋回波T2 mapping序列，TR 1 100 ms，TE取9、18、27、36、45、54、63、72 ms，FOV 16 cm×16 cm，矩阵256×256，层厚 3 mm，层间隔0 mm。

采用Functool软件对图像进行后处理获得T2 mapping伪彩图，依据质子加权像三维定位并参考大体病理确定软骨病变区域并放置ROI，ROI大小约为1.3 mm2，测量关节软骨T2值，重复测量3次取平均值作为最终结果。

1.5 病理学检查 采用空气栓塞法处死动物，取下股骨髁，肉眼观察确定股骨髁关节软骨病变最严重区域并记录位置供MR评估和病理切片参考。标本经常规固定、脱钙、包埋后对软骨病变最严重区域切片，行MMP-1免疫组化染色(Santa Cruz公司)，阳性区域为黄色或棕黄色，采过Image Pro Plus软件计算每高倍视野内阳性细胞的积分光密度(IOD)，并选取6个高倍视野取平均值作为最终结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计分析软件。对连续变量先行正态性及方差齐性检验，分别用±s或中位数(上下四分位数)表示。非连续变量以例数、百分数表示。非连续变量比较采用χ2检验。多组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-WallisH检验，Kruskal-WallisH检验中两两比较采用调整后的P值，多因素分析采用最优尺度回归[10]。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各实验组间动物的性别、体质量差异无统计学意义(χ2=0.667，P=0.881；F=0.275，P=0.843)。

各实验组间关节软骨T2值及MMP-1含量的总体差异有统计学意义(P均<0.001)。模型对照组关节软骨T2值高于其他3组(P均<0.01)，正常对照组、盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组间关节软骨T2值差异无统计学意义。盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组间关节软骨MMP-1含量差异无统计学意义，但其关节软骨MMP-1含量低于模型对照组(P均<0.05)、高于正常对照组(P<0.05)。见表1、图1。

对全部实验参数进行最优尺度回归分析，因变量为关节软骨T2值，自变量为实验分组(干预)情况和MMP-1含量。结果表明回归模型具有统计学意义 (F=18.815，P<0.01)。该模型决定系数和调整后的决定系数分别为0.734、0.695，提示模型中约70%的部分可被目前的因素解释，同时可能还有其他因素未纳入模型。对所纳入因素进行分析，实验分组(干预)情况、关节软骨内MMP-1含量与关节软骨T2值有统计学关联(P<0.05)，其重要程度分别为0.438、0.561，二者和为0.999，提示上述两因素占目前模型总解释度的99.9%(表2)。所有自变量的容差均>0.1，说明各因素之间无严重共线性，回归模型可靠(表2)。变量转换后的量化图显示：①模型对照组的软骨T2值量化分级高于其他3组，且其他3组的T2值量化分级类似(图2A)；②软骨MMP-1含量与T2值量化分级为非线性关系，随MMP-1含量的升高，T2值先缓慢上升再快速上升(图2B)。

3 讨论

关节软骨退变与损伤时发生胶原纤维结构破坏、蛋白多糖丢失及软骨内自由水含量增加[11]。此外，软骨退变时MMP-1表达量上调，促进软骨基质内Ⅱ型胶原降解，可导致软骨水含量上升[3,12]。MR T2 mapping通过定量测量软骨横向弛豫时间(T2值)，可间接反映软骨中水含量，是一种无创、准确评估软骨早期退变并监测软骨修复的工具[7,13]。

止痛健骨方具有活血祛瘀、通络止痛、补肝益肾、强健筋骨的作用，可以改善兔膝关节骨关节炎模型的关节活动度、增加关节软骨未钙化与钙化厚度的比值、延缓软骨退变[4]。本研究显示，兔KOA模型中关节软骨内MMP-1含量较正常对照组上升，但止痛健骨方和盐酸氨基葡萄糖可以降低兔KOA模型关节软骨内MMP-1含量，这验证了KOA中存在由MMP-1过表达导致的软骨基质降解的现象，与冯小波等[3，14]的研究相符，同时也提示止痛健骨方具有降低退变关节软骨内MMP-1表达量的作用。

表2 最优尺度回归模型结果

图1 各组关节软骨MMP-1免疫组化染色、MR T2 mapping伪彩图 A～D.依次为正常对照组、模型对照组、盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组的软骨MMP-1免疫组化染色图(×400)； E～H.依次为对应组的T2 mapping伪彩图，其T2值分别为49.50 ms、54.89 ms、48.00 ms、48.50 ms

图2 量化转换图 A.实验分组(A组：正常对照组；B组：模型对照组；C组：盐酸氨基葡萄糖治疗组；D组：止痛健骨方治疗组)； B.软骨MMP-1含量

本研究的单因素和多因素(最优尺度回归)分析均显示模型对照组关节软骨T2值高于正常对照组、盐酸氨基葡萄糖治疗组、止痛健骨方治疗组，且后3组的关节软骨T2值无明显差异。该结果说明用关节软骨T2值作为中药疗效的评价指标具有一定的可行性。此外，最优尺度回归还显示关节软骨T2值与MMP-1含量之间呈先缓慢上升后快速上升的非线性关系，这可以解释单因素分析中各组间关节软骨T2值与MMP-1含量分布趋势存在的差异。随着KOA进展，关节软骨MMP-1表达量逐渐上升，软骨基质的降解程度加重，其内水含量不断累积，进而导致关节软骨T2值上升，该过程的非线性关系可能来自两方面：水含量与T2值间的非线性、MMP-1含量与水含量间的非线性。Wei等[15]在其MR T2 mapping成像诊断早期软骨损伤的研究中虽然采用线性模型得到了可以令人接受的结果，但该研究中软骨水含量与T2值的散点图暗示了二者的非线性关系，且与本研究所得结果非常类似，支持了笔者关于该非线性关系来源的第一个推测。而是否存在关节软骨MMP-1含量与水含量的非线性关系，还需要进一步研究探讨。

本研究的局限性：①在影像和病理上分别采用软骨T2值和MMP-1含量作为评价标准，虽然一定程度上克服了主观评级的误差，但软骨退变还受其他多种因素影响[16-17]；②止痛健骨方复方中的有效成分本研究并未涉及，需要在今后的研究中进一步探讨。

综上所述，本研究初步证实了采用MR T2 mapping成像评价止痛健骨方治疗KOA软骨损伤疗效的可行性，同时发现KOA关节软骨T2值与MMP-1含量呈非线性关系，进一步拓宽了临床医生对KOA影像与病理相对关系的认识，具有一定的社会经济价值。

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消息

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EvaluationofefficacyofZhitong-JiangurecipesintreatmentofcartilageinjuryinosteoarthritisusingMRT2mapping:Anexperimentalstudy

ZHANGKun1,2,ZHUKejian2,3*,TANXuyi4,HUANGGang4,LIPing1,SHENHongrong1,ZHULu5,MASijing6,ZHUPei6

(1.DepartmentofRadiology,FirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China; 2.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 3.DepartmentofInternalMedicine, 4.DepartmentofOrthopedics, 6.DepartmentofPharmacy,theAffiliatedHospitalofHunanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China; 5.DepartmentofUltrasound,thePeople'sHospitalofHunanProvince,Changsha410005,China)

ObjectiveTo explore the value of MR T2 mapping imaging in evaluation of the effection of Zhitong-Jiangu recipes in treatment of cartilage injury in osteoarthritis.MethodsThe models of osteoarthritis in the knee of New Zealand white rabbits were made with intra-articular injection of papain. Totally 48 New Zealand white rabbits were randomly divided into normal control group, model control group, glucosamine hydrochloride treatment group and Zhitong-Jiangu recipes treatment group. MR T2 mapping was performed on the knee and the content of MMP-1 in articular cartilage was analyzed with immunohistochemistry 4 weeks after treatment. The differences of T2 value and MMP-1 content of articular cartilage among the four groups were compared. The correlation among the different intervention methods, MMP-1 content of articular cartilage and the T2 value of articular cartilage were analyzed.ResultsT2 value of articular cartilage in the model control group was significantly higher than that in the other three groups (allP<0.01), and there was no significant difference of T2 value among the other three groups. The MMP-1 content of articular cartilage in glucosamine hydrochloride treatment group and Zhitong-Jiangu recipes treatment group was lower than that in model control group (bothP<0.05), and was higher than that in normal control group (bothP<0.05). There was no significant difference between the two groups. The relationship between MMP-1 content and T2 value of articular cartilage was nonlinear. With the increase of MMP-1 content, T2 value first increased slowly and then increased rapidly (P<0.05).ConclusionMR T2 mapping imaging is helpful to evaluating the efficacy of Zhitong-Jiangu recipes in treatment of cartilage injury in osteoarthritis in rabbit models. The relationship between MMP-1 content and T2 value of articular cartilage may be nonlinear.

Osteoarthritis; Cartilage; Zhitong-Jiangu recipes; Magnetic resonance imaging; T2 mapping; Matrix metalloprotease 1

国家自然科学基金青年科学基金项目(81603482、81503452)、湖南省自然科学基金资助项目(2016JJ6115)、湖南中医药大学校级青年教师科研基金项目(校行科字[2015]5号)。

张堃(1987—)，男，甘肃金昌人，博士，副主任医师。研究方向：医学影像在中西医结合临床研究中的价值和影像引导下的介入治疗。E-mail： kunzhang0102@163.com

朱克俭，湖南中医药大学中西医结合学院，410208；湖南省中医药研究院附属医院内科，410006。E-mail： 0731zkjo@263.net

2017-08-04

2017-10-12

R681; R445.2

A

1672-8475(2017)11-0694-05

10.13929/j.1672-8475.201708005