建立改良法兔VX2肝癌模型及肝动脉联合门静脉插管的应用

含 笑，胡茂能，吴鸿峰，余 梁，王国亮，周丽芬

(合肥市第三人民医院影像中心，安徽 合肥 230022)

·基础与实验研究·

建立改良法兔VX2肝癌模型及肝动脉联合门静脉插管的应用

含 笑，胡茂能*，吴鸿峰，余 梁，王国亮，周丽芬

(合肥市第三人民医院影像中心，安徽 合肥 230022)

目的采用改良法建立兔VX2肝癌模型，探讨经肝动脉联合门静脉插管技术的应用并分析其影响因素。方法对60只健康新西兰大白兔行改良开腹穿刺接种法移植肝癌，并行肝动脉联合门静脉造影，根据术后是否发生短期死亡(术后7天内)分为存活组和死亡组，将可能导致实验兔死亡的因素进行单因素分析，以有统计学意义的指标为自变量，建立二分类Logistic回归模型，分析导致实验兔死亡的独立危险因素。结果60只实验兔均移植肿瘤成功，9只(9/60，15.00%)实验兔术后短期内死亡，51只(51/60，85.00%)存活。单因素分析显示两组间体质量<2.5 kg、术中追加麻醉、手术时间≥60 min、切口长度≥5 cm及总出血量≥25 ml为相关影响因素(P均<0.05)。Logistic回归分析筛选出体质量<2.5 kg、术中追加麻醉及出血量≥25 ml为手术死亡的独立危险因素(P均<0.01)。结论改良法兔VX2肝癌模型建立成功率较高；选择体重较大的实验兔，同时加强手术技巧的训练，减少术中出血量和避免术中追加麻醉是进行肝动脉联合门静脉造影时降低实验兔死亡率的有效措施。

兔；VX2肝癌；放射学，介入性；回归分析

经导管动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)已成为中晚期原发性肝癌的标准治疗方式[1]，但单纯TACE具有短期复发，且复发率较高的缺点，肝癌存在肝动脉和门静脉双重血供是其复发的主要原因。研究[2-4]发现采用经肝动脉联合门静脉化疗栓塞术治疗中晚期肝癌患者的疗效好于单纯TACE，但目前仍缺乏大样本研究证实。VX2兔因体型大、肿瘤生长迅速及肿瘤血液供应与人体肝细胞癌相似等优点被用作肝癌研究的动物模型[5]，但肝动脉联合门静脉插管造影的研究较少[6]。本研究采用改良法建立兔VX2肝癌模型，并行肝动脉联合门静脉插管造影，并分析其影响因素。

1 材料与方法

1.1 改良法兔VX2肝癌模型建立 选取60只健康新西兰大白兔(安徽医科大学动物实验中心提供，编号201615838)，雌兔25只，雄兔35只，体质量1.75～2.80 kg，平均(2.16±0.48)kg。荷VX2瘤兔2只(安徽省立医院介入科惠赠)，雌雄各1只，体质量分别为1.81 kg和2.03 kg。以外科法剥离荷VX2瘤兔后肢瘤体，取瘤体边缘生长旺盛的鱼肉样组织，置于50 ml生理盐水+2万单位庆大霉素溶液中，使用眼科剪将瘤块剪成最大径约2 mm的碎块，以备肿瘤移植使用。以苯巴比妥钠(100 mg/kg体质量)经耳缘静脉缓慢推注麻醉动物，采用改良开腹穿刺接种法进行肿瘤移植：于剑突下正中偏左作一长约2 cm纵行切口，打开腹腔暴露肝脏左内叶，以4F扩张鞘管斜行轻柔刺破肝包膜，插入肝脏内约5 mm，经鞘管内芯推入3～5个瘤块，再以2 mm×2 mm×5 mm的明胶海绵条封堵穿刺通道后拔出，缝合上腹切口。术后均常规抗感染：实验兔后肢肌肉注射青霉素钠80万单位/天，连续3天。

1.2 经肝动脉联合门静脉插管造影 于瘤块接种后第15天行肝动脉联合门静脉造影。术前3天予以正常饮食之半量喂养，术前4 h禁饲禁饮；术后将动物置于烤灯下观察苏醒，术后6 h开始给水，12 h予以术前1/3饲料喂养，术后第4天恢复正常饲喂。

1.2.1 肝动脉造影 实验兔右侧腹股沟区备皮、常规消毒铺巾，于股动脉搏动区作纵行切口，钝性分离至完全暴露股动脉，穿4号缝合线置于近心端，提紧缝线，暂时阻断血流，采用眼科剪将股动脉远心端剪一小斜行切口，将3F微导管(泰尔茂株式会社)直接插入股动脉。之后于透视下将微导管置于腹主动脉(约T12水平)进行造影，再于腹主动脉前壁或偏左侧壁(T12/L1椎体水平)进入腹腔动脉后再行腹腔动脉手推造影，采用路图技术超选择插管进入肝总动脉，连接高压注射器行DSA。对比剂(碘佛醇，江苏恒瑞医药股份有限公司)流速为2～3 ml/s，总量6 ml。

1.2.2 门静脉造影 肝动脉造影结束后，采用腹正中切口(切口长度<5 cm)，逐层打开腹壁，清晰暴露门静脉。将5号静脉输液针折成直角，水平段斜行插入门静脉，回抽见血后用动脉夹妥善固定，连接高压注射器行DSA，对比剂流速为3～5 ml/s，总量8～10 ml。术毕拔针，以纱布压迫10 s左右止血。逐层缝合切口后包扎伤口。

1.3 观察指标 根据实验兔术后7天内是否存活分为存活组和死亡组，观察指标包括性别、体质量、切口长度、手术时间、腹腔暴露时间、术中出血量及术中是否追加麻醉等。比较两组实验兔的一般特征和术中情况，分析可能影响实验兔术后短期死亡的相关因素。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。计数资料以例数或百分比表示，计量资料以±s表示。采用χ2检验对可能导致实验兔死亡的相关指标行单因素分析，以有统计学意义的指标为自变量，以造影术后7天内是否死亡为因变量(Y=1，0；存活为0，死亡为1)，采用最大似然比检验进行多因素回归分析，建立多因素二分类Logistic回归模型，获得各指标的回归系数β、标准误(standard errors, SE)、比值比(odds ratio, OR)及95%可信区间(confidence interval, CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤移植及造影所见 全部60只实验兔均移植肿瘤成功，未出现腹腔内广泛转移及积液等。所有移植瘤均位于肝左叶，其中4只(4/60，6.67%)为多发(均为2个瘤块)，其余56只(56/60，93.33%)为单发。种植成功的VX2肿瘤呈灰白色结节状，与正常肝组织分界清晰(图1)。肝动脉联合门静脉造影显示肿瘤血供丰富，其中55只(55/60，91.67%)肿瘤血供仅来自肝动脉(图2)，5只(5/60，8.33%)门静脉参与供血(图3)。术后7天内存活51只(51/60，85.00%)，死亡9只(9/60，15.00%)。

2.2 影响术后死亡率的单因素分析 对可能导致实验兔死亡的因素，包括性别、体质量、切口长度、手术时间、腹腔暴露时间、术中出血量及术中是否追加麻醉等进行单因素分析，结果显示体质量<2.5 kg、术中追加麻醉、手术时间≥60 min、切口长度≥5 cm及总出血量≥25 ml为相关影响因素(P均<0.05，表1)。

2.3 影响术后死亡率的多因素分析 以上述单因素(体质量<2.5 kg、术中追加麻醉、手术时间≥60 min、切口长度≥5 cm及总出血量≥25 ml)作为自变量，行非条件二分类Logistic回归分析，筛选得出体重<2.5 kg、术中追加麻醉及出血量≥25 ml是动物术后死亡的独立危险因素(P均<0.01，表2)。

3 讨论

肝癌具有丰富的血供和新生血管形成，后者对肿瘤的生长和转移起重要作用[7]。VX2肝癌是Shop病毒在兔皮肤上诱发的一种鳞癌，经过传代后可作为兔移植性肿瘤，在肝脏的移植成功率较高[8]。建立VX2模型的方法较多，既往[9-10]常采用经腹部正中切口开腹穿刺法，拉出肝左叶，将瘤块直接植入肝脏内，该方法易刺破肝内血管，导致早期转移；同时呼吸运动易导致瘤块溢出而出现腹腔广泛转移或切口转移。本研究对上述方法加以适当改良，采用经皮肝穿刺扩张鞘管斜行轻柔刺破肝包膜，推注瘤块后同时经鞘管注入明胶海绵条；采用正中偏左切口可直视肝左叶，无需拉出肝脏，操作简便，移植瘤位置易固定。本组60只实验兔均移植成功，腹腔内未出现广泛转移及积液等。鲁东等[11]比较改良接种法与常规开腹穿刺接种法，发现改良法移植成功率为95%，高于常规开腹穿刺法(85%)，且肝内多发病灶发生率及网膜或腹壁种植转移率均有显著下降(P均<0.05)。

介入治疗已成为肝癌的主要姑息疗法[2]，VX2实验兔的肿瘤血供与人类相同，主要来自肝动脉，且其肝动脉内径较粗，可允许行插管操作[8]。目前研究[12-13]认为肝癌80%以上的血供来源于肝动脉，供应肿瘤中心区域，而门静脉供应肿瘤周边区域。乏血供肝脏肿瘤多以门静脉供应为主。此外，还有15%无包膜肝癌的门静脉血供超过肝动脉。本组9只实验兔于术后7天内死亡，Logistic回归分析显示影响实验兔术后短期死亡的独立危险因素为实验兔体质量过低(<2.5 kg)、术中追加麻醉及术中出血量过大(≥25 ml)，这可能与体质量较小的实验兔血容量较少、耐受性差、血管较细致手术难度增加等因素有关。本研究采用大剂量苯巴比妥钠(100 mg/kg体质量)经实验兔耳缘静脉注射，其半数致死量为340 mg/kg体质量，半衰期较长。本实验中因追加麻醉导致实验兔死亡，可能与以下原因有关：不熟悉实验步骤、微导管插管技巧生疏致手术时间延长，术中实验兔清醒；进行耳缘静脉注射苯巴比妥钠时出现药液外渗，一次性麻醉程度不足，导致术中需要追加麻醉，因药物过量而导致死亡。此外，术中出血量超过25 ml也是导致实验兔术后短期死亡的独立因素，可能的原因为较大出血量导致实验兔对手术的耐受性差，本组1只实验兔(出血量约40 ml)在手术结束后1 h内死亡；术后伤口愈合延迟，机体抗感染能力下降。

表1 影响VX2肝癌兔双介入术后7天内死亡的单因素分析(只)

表2 影响VX2肝癌兔双介入术后7 天内死亡的多因素Logistic回归参数估计结果

图1 改良法VX2肝癌兔移植术后见位于肝左叶孤立移植瘤，呈灰白色，与周边组织分界清晰 图2 肝动脉微导管造影示肿瘤为孤立病灶，位于肝左叶，血供丰富 图3 门静脉直接插管造影示门静脉参与肝左叶肿瘤供血

本实验结果提示：①操作时需熟练掌握介入操作技术及插管技巧，在减少损伤的同时缩短手术时间；②在耳缘静脉注射麻醉药物时，于耳下方采用自制硬卡片固定，可避免因动物躁动导致的药液外渗及术中追加麻醉；③选择正中偏左切口，尽量靠近移植瘤，可使切口较小，从而减少损伤、降低出血量；④门静脉插管时尽量一次成功，可以减少出血量，经直视下行门静脉插管操作简便，不需扩大切口即可获得清晰的视野。

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EstablishingimprovedrabbitmodelbearingVX2livertumorandapplicationofhepaticarteryandportalveincatheterization

HANXiao,HUMaoneng*,WUHongfeng,YULiang,WANGGuoliang,ZHOULifen

(ImagingCenter,theThirdPeople'sHospitalofHefei,Hefei230022,China)

ObjectiveTo establish rabbit model bearing VX2 liver tumor using improved technique, and to analyze the relevant impact factors of hepatic artery and portal vein catheterization.MethodsTransplanted liver tumors of 60 healthy New Zealand white rabbits were established through open abdominal puncture and hepatic artery and portal vein catheterization. The rabbits were divided into A group (survival) and B group (death) according to whether a short-term (within 7 days after surgery) death occurred or not. The univariate analysis of the factors which could lead to the death of rabbits were analyzed. TheLogisticregression models were established with parameters which were significantly different between the 2 groups, and independent risk factors which could lead to the failure of the experiment were analyzed.ResultsVX2 tumors were successfully implanted in the liver to all 60 rabbits. Nine (9/60, 15.00%) rabbits died within 7 days, while 51 (51/60, 85.00%) rabbits survived. weight < 2.5 kg, additional intraoperative anesthesia, operation time ≥60 min, length of incision ≥5 cm and blood loss of operation ≥25 ml were impact factors (allP<0.05). Weight < 2.5 kg, additional intraoperative anesthesia and the blood loss of operation ≥25 ml were independent risk factors for death (P<0.01).ConclusionRelative high success rate of building rabbit models bearing VX2 liver tumor may achieved using hepatic artery and portal vein catheterization. Larger weight of rabbits, training of surgical skills, less intraoperative blood loss are helpful to avoid intraoperative additional anesthesia, thus reducing mortality of rabbits.

Rabbits; VX2 liver tumor; Radiology, intervention; Regression analysis

含笑(1981—)，男，安徽全椒人，硕士，主治医师。研究方向：恶性肿瘤及外周血管疾病的介入治疗。E-mail: 29435205@qq.com

胡茂能，合肥市第三人民医院影像中心，230022。E-mail: hmn596@163.com

2017-06-11

2017-09-11

R73; R816

A

1672-8475(2017)11-0690-04

10.13929/j.1672-8475.201706018