噬菌体治疗泛耐药鲍氏不动杆菌重症感染小鼠的研究

闫李侠，黄至澄，任应鹏，李恪梅，陈保文，王国治

噬菌体治疗泛耐药鲍氏不动杆菌重症感染小鼠的研究

闫李侠1，黄至澄1，任应鹏1，李恪梅2，陈保文2，王国治2

目的探讨噬菌体治疗泛耐药鲍氏不动杆菌重症感染小鼠的疗效。方法以SPF级昆明小鼠建立小鼠感染泛耐药鲍氏不动杆菌的模型，分为实验组和对照组，实验组使用噬菌体AB46治疗，对照组给同等体积的肉汤治疗，统计比较两组小鼠的生存率，进行脾菌数分析。结果泛耐药鲍氏不动杆菌1∶10稀释实验组与对照组P=0.020<0.05，有统计学差异；1∶2、1∶5稀释组分别为P=0.650，P=0.170，均>0.05，无统计学差异；1∶50稀释的实验组与对照组均无小鼠死亡，脾菌数计数结果P=0.026，有统计学差异。结论噬菌体治疗泛耐药鲍氏不动杆菌重症感染小鼠是一种有效的治疗方法，可明显提高小鼠的生存率，在感染较轻的情况下可以明显降低小鼠的脾菌数。

噬菌体；治疗；鲍曼不动杆菌；感染

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是一种条件致病菌[1]，所致的感染常见于重症感染的患者[2-4]，但是近年来鲍曼不动杆菌已经导致各种情况的耐药，并出现了全耐药的鲍曼不动杆菌[5-7]，一旦感染其后果相当严重，而当前的治疗方法仅能采用多粘菌素进行治疗[8]，但是多粘菌素的肾毒性很大，治疗效果不理想，目前已经在多个国家禁止使用[9-10]。本文以昆明小鼠建立全耐药鲍曼不动杆菌的重症感染模型，从医院污水中获得的噬菌体治疗之。

1 材料与方法

1.1主要试剂及实验器材 普通营养琼脂培养基、营养肉汤培养基(由中国药品生物制品检定所培养基室提供)。1 mL、5 mL、10 mL一次性使用无菌注射器，上海米沙瓦医科工业有限公司；微型离心机，德国eppendorf公司；0.2 μm一次性使用无菌过滤器，美国Pall公司；微量移液器，德国BRAND公司；微量移液器枪头，美国AXYGEN公司。

1.2实验材料 选用健康的6～8周龄(体重20 g左右)SPF级昆明小鼠作为实验动物，所有小鼠由中国药品生物制品鉴定研究院实验动物中心提供。泛耐药鲍氏不动杆菌A46由中国药品生物制品鉴定研究院抗生素室提供，鲍氏不动杆菌裂性噬菌体AB46为本实验室自行分离获得。

1.3重症感染模型建立 将泛耐药鲍氏不动杆菌A46加入少量于大管肉汤培养基中，36 ℃培箱培养18 h，再将此菌液铺于大管斜面营养琼脂培养基，36 ℃培养16 h，用无菌生理盐水将其洗下，稀释至不同倍数，用比浊法确定浓度，并同时用菌落计数法测定其活菌数。将不同稀释倍数的泛耐药鲍氏不动杆菌A46各取0.5 mL注射于5组SPF级昆明小鼠的腹腔内(每组10只，雌雄各半)，观察7 d，选择导致一组小鼠全部死亡的最小剂量[6]作为绝对致死量(LD100)。用此剂量(每只小鼠0.5 mL菌A46)建立重症感染模型，发现重症感染泛耐药鲍氏不动杆菌的小鼠往往在24 h内全部死亡。为了同时了解感染程度较轻的情况下噬菌体的治疗效果，同时采用了不同稀释倍数的剂量作为另外几组小鼠的感染剂量。

1.4噬菌体的治疗效果分析 设定5个大组，每大组20只，做为不同浓度泛耐药鲍氏不动杆菌感染小鼠的剂量组，每大组随机分为实验组和对照组，每组10只。各大组分别采用不同浓度泛耐药鲍氏不动杆菌感染小鼠，泛耐药鲍氏不动杆菌A46以5×1010cfu/mL为最高浓度，按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀释为5个梯度，所有小鼠腹腔注射剂量均是0.5 mL。实验组每只小鼠腹腔注射泛耐药鲍氏不动杆菌A46之后，使用效价为5×108的噬菌体AB46 0.5 mL腹腔注射治疗，对照组小鼠则不注射噬菌体，而注射等量营养肉汤培养液，观察小鼠生存情况并记录。于7 d后将未出现小鼠死亡大组的小鼠全部处死，然后取小鼠脾脏研磨，将实验组及对照组小鼠脾脏皆用10 mL无菌生理盐水研磨溶解后取100 μL，再按1∶10稀释后从中取100 μL铺于琼脂平皿中行菌落计数，由于所有小鼠均采用此方法稀释，最后统计学处理时直接处理平皿中的菌落数量。

1.5统计学方法 小鼠的生存率数据采用Fisher确切概率法，小鼠脾菌数资料采用配对t检验。统计学软件使用SPSS13.0。

2 结 果

2.1绝对致死量 经过反复多次实验后发现梯度稀释的菌液每只0.5 mL注射小鼠后，1010cfu/mL及更高浓度的菌液可导致一组小鼠24 h内全部死亡，死亡时间大多数在12 h之内，因此确定泛耐药鲍氏不动杆菌A46 1010cfu/mL，0.5 mL为小鼠致死剂量，此剂量感染的小鼠模型为重症感染模型。

2.2小鼠生存分析 泛耐药鲍氏不动杆菌A46以5×1010cfu/mL为最高浓度，依次按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀释，噬菌体治疗一次后观察疗效7d，发现并非所有小鼠可免于死亡。其中1∶2稀释组的实验组10只，生存5只死亡5只；对照组10只，生存3只死亡7只，经统计学分析实验组与对照组差异无统计学意义(P=0.650>0.05)。1∶5稀释组的实验组10只，生存6只死亡4只；对照组10只生存2只死亡8只，经统计学分析实验组与对照组差异无统计学意义(P=0.170>0.05)，说明这两组小鼠感染较重，噬菌体治疗无明显效果。但1∶10稀释组的实验组10只生存9只死亡1只，对照组10只生存3只死亡7只，经统计学分析P=0.020<0.05，差异有统计学意义，即实验组和对照组有区别，噬菌体治疗效果显著。1∶50稀释组，实验组与对照组各10只，均无小鼠死亡，说明噬菌体感染较轻时，小鼠生存率不受影响。

2.3小鼠脾菌数 1∶100稀释组脾脏落计数仅有1只实验组小鼠菌落计数为1，其余小鼠菌落计数为0，无统计学意义。由于1∶2、1∶5、1∶10稀释组均有小鼠死亡，不进行脾菌数计数。1∶50稀释组无小鼠死亡，进行脾菌落计数，结果见表1，经统计学分析P=0.026<0.05，有统计学意义，接受噬菌体治疗组的小鼠脾脏菌落计数明显少于未治疗组，进一步证实噬菌体治疗效果显著。

表1 小鼠脾菌数计数结果
Tab.1 Count number of spleen count in mice

小鼠mice12345678910实验组Experiencegroup1311111113对照组Controlgroup133537535934922541

注：1∶50稀释组，P=0.026<0.05

Note：1∶50 dilution group,P=0.026<0.05

3 讨 论

鲍氏不动杆菌感染常见于重症感染患者，虽然本身是条件致病菌，但是目前耐药现象非常严重，并且已经出现泛耐药的鲍氏不动杆菌。因而，噬菌体治疗的研究重新受到重视。

本研究以不同剂量的泛耐药鲍氏不动杆菌感染小鼠，采用统一效价的噬菌体治疗，在一定的感染程度下，疗效是值得肯定的。但是噬菌体并不能保证所有被感染的小鼠存活，这与感染严重程度密切相关，当感染非常严重时，治疗与不治疗已经没有统计学意义，这与人类疾病发展的自然规律极为相似，临床上严重的感染，再有效的药也不可能使100%的病人免于死亡。再者，泛耐药鲍氏不动杆菌，虽是条件致病菌，但感染剂量大时很容易导致无基础疾病的小鼠很快死亡，死亡速度非常快，通常在12h内。当感染的菌量太小时，无论治疗与否，小鼠的生存都不会受到影响。此外，在预实验中发现鲍氏不动杆菌一旦导致小鼠的重症感染，噬菌体治疗后，存活而且脾菌数显示有菌的小鼠其生存状况都比较好，人为观察下看不出有菌和无菌小鼠的区别，这也许与观察时间不够长有关，在以后的研究中将会延长观察时间。

鲍曼不动杆菌感染有其自身的特点，噬菌体在一定条件下的确有保护宿主不受感染的能力，但是目前主要问题是裂解谱窄，提高效价比较困难，一方面需要更大量地寻找宽噬噬菌体，另一方面可以通过改造噬菌体的基因来解决。但同时噬菌体由于其生物学特性的特殊性，与抗生素相比无半衰期的限制，可能只需使用一次，只要宿主菌存在，它在体内可以自动增殖，不断裂解宿主菌。并且噬菌体高度专一，只破坏相对应的一种宿主菌，对人体内正常菌群无影响，这些绝对的优势，是它又被重新重视的重要原因。此外，噬菌体用作药物还需要长期毒性、异毒性及致畸作用等方面的全面更深入的研究。

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ThetreatmentofsevereinfectionofmicecausedbypandrugresistantAcinetobacterbaumanniiwithbacteriophages

YAN Li-xia1, HUANG Zhi-cheng1, REN Ying-pen1, LI Ke-mei2, CHEN Bao-wen2,WANG Guo-zhi2

(1.TaizhouCityfristHospitalofZhengjianProvince,Taizhou318020,China;2.InstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProductsBeijing100050,China)

We explored the effect of therapy with bacteriophages for pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiinfections. Kunming mice (Specific Pathogen Free) were divided into two groups: experimental group (severe infection caused by pandrug resistantAcinetobacterbaumannii) and the control group. The mice of experimental group were treated with Phages AB46 while the mice of control group were treated with broth. The survival rate was compared with statistical method and the spleen bacteria count was analyzed. Results showed that there were statistical difference between the experimental group and control group of Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniigroups of 1∶10 dilution,P=0.020<0.05. There were no statistical difference between each two groups of 1∶2 (P=0.650) and 1∶5 (P=0.170) dilution, both were>0.05. There were no dead mice in groups of 1∶50 dilution with statistical difference of spleen bacteria count,P=0.026. Therapy with phages was an effective method to control infection caused by Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiwhich could increase the survival rate and decrease spleen bacteria count of the mice with light infection.

bacteriophage; treatment;Acinetobacterbaumannii; infection

Wang guo-zhi，Email: tbtestlab@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.014

王国治，Email：tbtestlab@126.com

1.浙江省台州市第一人民医院检验科，台州 318020；

2.中国药品生物制品检定研究院，北京 100050

378

A

1002-2694(2017)10-0920-03

2017-06-23编辑李友松