氟比洛芬酯用于大鼠肠道术后镇痛与肠道安全性的研究*

孙晓晨 马晓冉 鞠 辉 冯 艺

（北京大学人民医院麻醉科，北京 100044）

氟比洛芬酯用于大鼠肠道术后镇痛与肠道安全性的研究*

孙晓晨 马晓冉 鞠 辉 冯 艺△

（北京大学人民医院麻醉科，北京 100044）

目的：探究氟比洛芬酯对结肠切除吻合术后大鼠的肠功能、疼痛及吻合口愈合的影响。方法48只6～8周龄雄性SD大鼠随机分为四组(n= 12)，行肠切除吻合术。从术毕起连续3日分别给予各组以下药物：脂肪乳(Z组，0.4 ml/d)、低剂量氟比洛芬酯[F1组，12.5 mg·(kg·d)-1]、中剂量氟比洛芬酯[F2组，25 mg·(kg·d)-1]、高剂量氟比洛芬酯[F3组，37.5 mg·(kg·d)-1]。于术后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h定时观察是否出现新鲜粪便；在术毕当日至术后第3日测定手术切口疼痛行为学变化。分别在术后第3天、第7天每组各处死6只动物，测定吻合口爆破压力，吻合部位COX-2表达（免疫组化法）及羟脯氨酸含量（碱水解法）。结果各组术后排便恢复时间无明显差异；术毕当日至术后第3日，F1、F2、F3组大鼠对10 g von Frey纤毛刺激手术切口的阳性反应率均较脂肪乳组下降(P＜ 0.01)。F3组大鼠在术后3天、7天的吻合口爆破压力、COX-2表达情况和羟脯氨酸含量均较Z组明显降低(P＜ 0.05)，F2组大鼠术后第7天吻合口的爆破压力较Z组明显降低、术后3天吻合组织COX-2表达较Z组明显降低(P＜ 0.05)。结论氟比洛芬酯可以改善大鼠肠道术后疼痛，对肠功能恢复无明显影响。高剂量的氟比洛芬酯可能增加吻合口愈合不良的风险。

氟比洛芬酯；肠吻合术；肠功能；疼痛行为学；吻合口愈合

术后疼痛可对机体造成许多不利影响，有效的术后镇痛不仅减轻病人痛苦，也利于疾病康复。氟比洛芬酯是目前广泛用于术后镇痛的非甾体抗药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，在骨科、妇科及胸科手术的术后镇痛中均具有显著的镇痛及抗炎效果。近年来，欧洲临床营养学与代谢学会提出快速康复外科理念，主张在择期肠道术后使用阿片类药物镇痛的基础上加用NSAIDs类药物进行术后镇痛，减少阿片类药物的不良反应，且NSAIDs的使用不受限制[1]。然而，一些临床研究结果表明，结直肠手术术后使用NSAIDs（双氯芬酸、塞来昔布）可能增加吻合口愈合不良的风险[2～4]。吻合口愈合不良是肠道术后严重的并发症，提升肿瘤复发率、感染风险及围术期死亡率[5]。国内亦有不少研究发现消化道术后使用联合氟比洛芬酯和阿片类药物镇痛可以减少术后不良反应[6,7]，但是关于氟比洛芬酯用于肠道术后安全性的报道甚少。本研究旨在通过动物实验观察不同术后镇痛剂量下的氟比洛芬酯对大鼠肠道术后肠功能、镇痛作用及吻合口早期愈合的影响。

方 法

1.实验动物

6～8周雄性SD大鼠48只，SPF级，体重270～330 g，购自北京维通利华实验动物有限公司。饲养条件：温度22±1℃，湿度55%，光照周期12小时/天。适应饲养环境3～5天后开始实验。

2.手术方法

大鼠术前禁食12 h，不禁水，经腹腔注射1万单位青霉素预防感染。参照Siemonsma等[8]的方法，行肠道切除吻合术。在2%～3%异氟醚麻醉下，于腹部正中做3～4 cm切口，于腹膜返折上3 cm处离段降结肠，切除1 cm肠管。用6-0 Prolene线进行8～10针间断缝合，再用3-0慕丝线逐层关闭腹壁和皮肤。术后自由进食水，单笼饲养。

3.实验分组

大鼠随机分为四组：脂肪乳组（Z组）、氟比洛芬酯低剂量组（F1组）、氟比洛芬酯中剂量组（F2组）、氟比洛芬酯高剂量组（F3组），每组12只。从术毕开始分别经尾静脉给予中/长链脂肪乳注射液（250 ml；批号：80KD032；华瑞制药有限公司）0.4 ml/d；F1组：氟比洛芬酯注射液（5 ml：50 mg；批号：2E196T；北京泰德制药有限公司）12.5 mg·(kg·d)-1；F2组：氟比洛芬注射液25 mg·(kg·d)-1；F3组：氟比洛芬酯注射液37.5 mg·(kg·d)-1。每日分两次给予，两次给药间隔12小时，连续3日。在术后3日(postoperative day 3, POD 3)及术后7日(POD 7)两个时间点，每组各取6只大鼠沿原腹部切口进行二次手术，切取吻合部位肠管进行爆破压测量和分子生物学检查。

4.观察指标

（1）一般情况及排便恢复情况

观察大鼠术后一般状态及体重变化。于术后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h定时观察鼠笼内垫料，记录鼠笼内首次出现新鲜粪便颗粒的时间点，视为术后首次恢复排便时间。

（2）疼痛行为学测试

在术毕当日及术后第1、2、3日进行测试，测试时间选择在给予药后15 min至2 h内。所有测试均在8:00～16:00时间内完成。使用10 g von Frey纤毛测定腹部切口周围皮肤对机械刺激的反应。参照Winston等人的方法[9]，将大鼠置于透明有机塑料罩中，预适应20 min。测试点选择在腹部纵切口正中点向左旁开0.5 cm，以记号笔标记。纤毛垂直刺入，加压变弯成S形，一次试验连续刺激10次，每次刺激持续1～2 s，间隔10 s，大鼠出现挺腹动作或抓、舔腹部的行为，视为阳性反应。记录10次刺激中的阳性反应次数，以阳性反应率（%）表示。

（3）爆破压力测定

二次手术探查时，切取以吻合口为中心的一段2～3 cm长的肠管，进行爆破压测量。参照肖海军等人的方法[10]，将三通一端连接血压计气泵，一端连接水银刻度计，一端通过一段硬膜外导管连接肠管，自制爆破压测量装置。肠管近端用3-0线结扎牢固，远端用弯钳夹闭，浸于生理盐水中，打开三通所有阀门，用气泵向肠管内加压，待生理盐水溶液中出现第一个气泡时，水银刻度计的压力即为吻合口的爆破压。

（4）免疫组化法评价吻合组织处COX-2表达

爆破压测量完毕后，沿长轴剪开肠管，一部分做免疫组化染色，一部分做羟脯氨酸含量测定。标本固定，包埋，切片。常规脱蜡至水，EDTA修复，滴加3%双氧水；抗原修复；滴加1:300稀释的兔抗鼠COX-2抗体（Abcam，美国），4℃过夜；滴加羊抗兔二抗（KPL，美国），静置，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；DAB显色后，冲洗，复染，脱水，封片。于光学显微镜（Olympus，日本）下观察，以胞膜和（或）胞浆中出现棕黄色颗粒或弥漫分布的细腻颗粒为阳性细胞。随机选择3个高倍视野(400×)，计数每个视野的阳性细胞百分数和着色强度：阳性细胞百分数：阳性细胞＜ 5%(0分)；阳性细胞6%～25% (1分)；阳性细胞26%～50%(2分)；阳性细胞51%～75% (3分)；阳性细胞＞75% (4分)。着色强度：无色(0分)；浅黄(1分)；黄色(2分)；深棕色(3分)，两项平均得分相乘后；0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为阳性(++)；9～12分为强阳性(+++)[11]。以最终的阳性程度作为每张切片COX-2的表达强度。

（5）吻合组织羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸是组成胶原蛋白的重要氨基酸，在人体中为胶原蛋白所独有，测定羟脯氨酸的含量可以反应吻合口处胶原形成情况。采用碱水解法测定羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量。标本解冻、烘干、准确称重，水解。空白管、标准管、测定管均依次加入指示剂、调pH甲液、乙液至pH值在6.0左右。蒸馏水稀释，离心，检测。依次加入氯胺-T、过氯酸、对二甲氨基苯甲醛；离心取上清液；测各管吸光光度。根据公式计算羟脯氨酸含量（μg/mg湿重）。

5.统计分析

所有数据采用SPSS 19.0统计软件包进行分析，计量数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，继之以LSD法两两比较。计量资料间的相关性用Pearson相关系数r表示。相关系数显著性检验采用t检验。计数资料的两两比较采用X2检验。COX-2表达半定量分析采用等级资料多组间比较的Kruskal-Wallis非参数检验，两两比较采用Wilcoxon两样本秩和检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 一般情况

所有大鼠术前平均体重300±23 g，术后3 d平均体重较术前下降约30±4 g，术后7 d缓慢回升，较术前下降约15±4 g；各时间点相比较，术后3 d体重下降与术前相比具有统计学差异(P= 0.04)。共48只大鼠参加实验，一只F3组大鼠因完全性肠梗阻于术后第5天死亡。余47只大鼠术后精神状态好，无吻合口瘘、肠梗阻等并发症发生。

2. 排便恢复情况

所有大鼠均在术后60 h内恢复正常排便。在各观察时间点，各组大鼠排便恢复情况（见表1）。与Z组相比，F1、F2、F3组大鼠术后排便恢复情况无统计学差异(P= 0.48, 0.58, 0.27)。在术后24 h内，与Z组与F3组之间恢复排便动物数量亦没有明显差异(P= 0.15)。

3. 疼痛行为学测定

术后不同时间点各组大鼠对10 g纤毛刺激的阳性反应率(见图1)。从POD 0至POD 3，与Z组相比，F1、F2、F3组的阳性反应率均显著降低（P＜ 0.001）；与F1组相比，F2、F3组的阳性反应率较F1组低(P＜ 0.001)；与F2组相比，F3组仅在D1时间点，F2组的阳性反应率显著高于F3组(P= 0.02)。

4.吻合口爆破压

各组大鼠吻合口的爆破压力（见表2）。与POD 3相比，各组POD 7的爆破压明显增加(P＝0.001)。在POD 3，F3组的吻合口爆破压较Z组、F1组及F2组显著降低(P= 0.001, 0.002, 0.008)。在POD 7，与Z组相比，F2组及F3组的爆破压明显降低(P= 0.011, 0.014)。余相同时间点各组间无明显差异。

5. COX-2表达

COX-2在术后吻合部位组织中表达丰富（见图3），半定量评分结果（见表2）。在POD 3，F2、F3组COX-2的半定量评分较Z组明显降低(P=0.006, 0.004)。在POD 7, F3组COX-2的半定量评分较Z组明显降低(P= 0.026)。余相同时间点各组间无明显差异。

6. HYP含量及其与爆破压力的相关性

（1）肠组织羟脯氨酸含量

各组吻合部位组织羟脯氨酸含量（见图4）。与POD 3 d相比，各组在POD 7 d的HYP含量明显增加(P＜ 0.05)。在POD 3 d及POD 7 d，F3组HYP含量均较Z组显著降低(P= 0.045, 0.002)。余相同时间点各组间无明显差异。

表1 术毕各观察时间点恢复排便的大鼠数量Table 1 Numbers of rats that recovered defecation at different observation time after surgery

（2）吻合口处羟脯氨酸含量与爆破压力的相关性

图1 各组大鼠对10 g纤毛刺激的阳性反应率***P ＜ 0.001，与 Z组相比；###P ＜ 0.001，与F1组相比；△P ＜ 0.05，与F2组相比Fig.1 Response frequencies to mechanical stimulation of the abdomen with 10 g von Frey fi lament between groups***P ＜ 0.001, compared with group Z; ###P ＜ 0.001, compared with group F1; △P ＜ 0.05, compared with group F2.

在POD 3及POD 7，大鼠吻合口处羟脯氨酸含量与爆破压力之间相关系数r分别为0.37 (P= 0.07)，0.46 (P= 0.02)。术后7天HYP含量与爆破压力之间的相关关系（见图5）。

图2 各组吻合口的爆破压力*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与 Z组相比；##P ＜ 0.01，与F1组相比；△△P ＜ 0.01，与F2组相比Fig.2 Bursting pressure of colon anastomosis between groups*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Z; ##P ＜ 0.01,compared with group F1; △△P ＜ 0.01, compared with group F2.

表2 各组吻合组织COX-2表达强度的半定量分析Table 2 Results of semi-quantitative integrals on the intensity of COX-2 expression in stoma tissue between groups

图3 各组吻合组织COX-2表达（免疫组化法，×200，bar scale = 200 μm），图中箭头所指为免疫反应阳性细胞Fig.3 The expression of COX-2 in stoma tissue between groups (immunohistochemistry, ×200，bar scale = 200 μm). Arrows represent immune staining positive cells.

图4 各组吻合组织处羟脯氨酸（HYP）含量*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与Z组相比Fig.4 Concentration of hydroxyproline in stoma tissue between groups*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Z.

图5 术后7天吻合口处羟脯氨酸含量与爆破压力的相关性Fig.5 Correlation between concentration of HYP and bursting pressure at POD 7

讨 论

本研究结果显示，与对照组相比，使用氟比洛芬酯对术后排便恢复情况无明显影响，提示氟比洛芬酯无明显抑制肠蠕动。镇痛效果方面，氟比洛芬酯明显降低了大鼠结肠术后对机械刺激的反应，且在每日12.5～25 mg/kg剂量下随着药量增加镇痛效果增强。这与Kitamura等人观察到每日20～50 mg/kg的氟比洛芬酯对大鼠结直肠扩张内脏痛模型具有随剂量增加，镇痛效果增强的作用是一致的[12]。研究中F2与F3组之间疼痛行为学差异不明显，提示随着剂量继续增加，镇痛出现了封顶效应。

本研究中药物的剂量是参照人与大鼠之间按体表面积折算的等效剂量确定的[13]，大鼠的等效剂量相当于人的6.25倍。三个氟比洛芬酯组的剂量对应成等效的人体剂量每日分别为2 mg/kg，4 mg/kg，6 mg/kg。临床上氟比洛芬酯用于术后镇痛的剂量一般为每日1.5～3 mg/kg，研究设定F1、F2组的剂量分别对应临床常用剂量、说明书中最大剂量，而F3组是为进行安全性评估所设。安全性方面，本研究显示，F1组大鼠未出现明显的爆破压下降以及COX-2表达、HYP含量的变化，提示在临床镇痛剂量下的氟比洛芬酯的安全性是可以接受的。

本研究观察到F3组大鼠术后吻合口的爆破压力、COX-2表达和HYP含量均较Z组降低，提示在高剂量下的氟比洛芬酯可能是通过抑制COX-2的表达影响肠道损伤修复过程，增加吻合口瘘的风险。这与许多临床和动物实验观察到的，NSAIDs药物可能增加肠道术后吻合口瘘的风险是一致的[2～4,14,15]。肠吻合口的愈合遵循组织愈合的各阶段过程，在愈合早期，炎症反应中炎细胞浸润、趋化、聚集，吞噬和清除坏死组织，新生毛细血管和幼稚成纤维细胞不断形成，产生胶原纤维、加固细胞外基质，促进创口愈合。de Hingh等发现肠道术后使用COX-2抑制剂塞来昔布，减少吻合口处COX-2的表达，增加吻合口愈合不良的风险[15]。COX-2催化生成重要的炎性介质前列腺素(prostaglandins, PGs)，可以促进吻合口处早期胶原蛋白生成[16]和血管内皮生长因子（VEGF）的生成[17]，在促进组织修复中发挥重要作用。

羟脯氨酸是胶原纤维在胶原酶作用下分解的产物，测定羟脯氨酸含量可以反映胶原纤维的水平。新合成的胶原使愈合组织具有一定张力和韧性，因而结肠组织的爆破压力与胶原含量存在有一定的相关性[18]。本研究显示术后7天较术后3天的吻合口的爆破压力和羟脯氨酸含量均有显著增长，且在术后7天羟脯氨酸含量与爆破压力存在一定程度的相关性，这符合组织愈合的基本过程。就F2组而言，本研究仅在术后7天观察到爆破压力较Z组降低而HYP含量无明显差异，在术后3天未观察到爆破压力及HYP的显著变化。提示羟脯氨酸的含量并不能完全反应组织愈合的强度，结肠组织愈合强度可能还与胶原纤维的交联排列及成熟度等有关。

本研究中分组和时间点较多，平均每组各时间点的样本量较小，今后的研究可以参照本研究中的阳性和阴性剂量，适当增加样本量，更深入地探氟比洛芬酯用于肠道术后的安全性及机制。

综上所述，肠道术后使用氟比洛芬酯可以有效镇痛且不影响肠功能的恢复。高剂量的氟比洛芬酯注射液可以抑制吻合口处COX-2表达，降低羟脯氨酸含量，增加吻合口愈合不良的风险；而低镇痛剂量的氟比洛芬酯注射液对肠吻合口愈合无明显不良影响，用于肠道术后镇痛是相对安全可靠的。由于导致吻合口愈合不良的危险因素多而复杂，临床上使用氟比洛芬酯进行肠道术后镇痛时，应采用小剂量并应密切关注术后肠道吻合口的愈合情况。

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STUDY OF FLURBIPROFEN AXETIL ON PAIN RELIEF AND INTESTINAL SAFETY AFTER COLON SURGERY IN RATS*

SUN Xiao-Chen, MA Xiao-Ran, JU Hui, FENG Yi△
(Department of Anesthesiology, Peking University People's Hospital, Beijing 100044, China)

Objectives: To investigate the influence of flurbiprofen axetil on bowel function, pain behavior and anastomotic healing after colon surgery.MethodsForty-eight male SD rats (6-8 weeks) were randomly divided into 4 groups (n=12), and all rats underwent colon resection and anastomosis. They

intralipid (Z group, 0.4 ml/d), low dose of fl urbiprofen axetil (F1 group, 12.5 mg/kg/d), moderate dose of fl urbiprofen axetil(F2 group, 25 mg/kg/d), and high dose of fl urbiprofen axetil (F3 group, 37.5 mg/kg/d), respectively, after surgery until postoperative day 3 (POD 3). Feces was observed at 12, 24, 36, 48 and 60 h after surgery. Pain behavior was measured from postoperative day 0 to day 3. Six rats in each group were sacri fi ced on postoperative day 3 and day 7, respectively. Bursting pressure, COX-2 expression (immunohistochemistry) and hydroxyproline levels (alkaline hydrolysis) of the perianastomotic tissues were measured.ResultsNo significant difference in postoperative recovery of defecation were observed among groups. F1, F2, F3 groups showed a lower response frequency to stimulation of von Frey filament (10 g) (P＜ 0.01). Compared with Z group, the bursting pressure, COX-2 expression and hydroxyproline levels were lower in F3 group both on POD 3 and POD 7 (P＜ 0.05); the bursting pressure on POD 7 and COX-2 expression on POD 3 were lower in F2 (P＜ 0.05).ConclusionFlurbiprofen axetil relieves postoperative pain after colon surgery with no remarkable in fl uence on bowel function. High dose fl urbiprofen axetil may increase the risk of anastomotic leakage after colon surgery.

Flurbiprofen axetil; Colon surgery; Bowel function; Pain behavior; Anastomotic healing

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.09.004

吴阶平医学基金会临床科研专项基金（2119000296）

△通讯作者 yifeng65@sina.com