两种不同神经病理性疼痛模型中自噬的改变*

刘永达 韩 光 王志彬 赵 平,△

（1中国医科大学附属盛京医院疼痛科，沈阳 110004; 2中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

·论 著·

两种不同神经病理性疼痛模型中自噬的改变*

刘永达1韩 光2王志彬1赵 平1,2△

（1中国医科大学附属盛京医院疼痛科，沈阳 110004;2中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

目的：通过观察坐骨神经压迫模型CCI (chronic constriction injury, CCI) 和脊神经结扎SNL(spinal nerve ligation, SNL) 两种经典的神经病理性疼痛模型中自噬特异性蛋白表达，探讨两种神经病理性疼痛中自噬的改变。方法：雄性SD大鼠（200～250 g）分为CCI假手术组（sC组），CCI组（C组），CCI +腹腔注射生理盐水组（C+V组），CCI+腹腔注射氯喹组（C+C组）， SNL假手术组（sS组），SNL组（S组），SNL＋腹腔注射生理盐水组（S+V组），SNL＋腹腔注射氯喹组（S+C组）。各组术前以及术后1、3、5、7天进行疼痛行为学测试。在术后7天sC组、C组取脊髓L4～6，sS组、S组取脊髓L4～5进行LC3、p62蛋白质免疫印迹检测。C+C组、C+V组、S+C组、S+V组检测LC3表达水平。结果：CCI模型和SNL模型产生明显的神经病理性疼痛行为学改变，注射氯喹导致机械痛阈降低；CCI模型中LC3-II、p62与假手术组相比升高；SNL模型与相应假手术组相比LC3-II升高，p62升高。C+C组和对照组相比LC3升高，S+C组与相应的对照组相比LC3升高。结论：不同神经病理性疼痛模型中自噬发生的改变不尽相同，并且抑制自噬可以增加神经病理性疼痛。增强自噬可以成为神经病理性疼痛治疗方法。

神经病理性疼痛；自噬；LC3；p62；氯喹

由躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接引起的神经病理性疼痛，其发病率高，严重影响病人的生活质量[1～3]。但是其发病原因不尽相同，临床表现个体差异明显，发病机制错综复杂，常规治疗效果并不令人满意，因此，阐明其发病机制并且提供相应临床策略成为了亟待解决的问题[4]。

自噬在神经退行性病变，癌症，炎症状态下都有改变[5]，综述表明，自噬可参与神经病理性疼痛的发生、发展、维持过程中[6]。本文首次通过对不同神经病理性疼痛模型分别应用氯喹抑制自噬，从而进一步佐证自噬在神经病理性疼痛中起到积极作用。本文通过对比CCI和SNL两种模型中自噬相关蛋白的表达，以及应用氯喹分别阻断CCI和SNL两种神经病理性疼痛自噬的降解步骤，从而说明自噬在神经病理性疼痛中的作用。

方 法

1.材料

SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，SPF级别，体重200～250 g，动物来自辽宁长生生物技术有限公司。实验前置于SPF级动物房中饲养3天，12 h黑/白光照，自由饮水进食。本实验动物使用经过中国医科大学动物伦理委员会批准。

采用随机数字表法将大鼠分为8组(n＝5)：CCI假手术组（sC组）进行除了结扎神经步骤以外的CCI手术操作组；CCI组（C组）建立CCI模型组；CCI空白组(C+V组)，建立CCI模型之后腹腔注射生理盐水15 mg/kg/d，每天1次至术后第5天；CCI氯喹组(C+C组)，建立CCI模型之后进行腹腔注射氯喹，15 mg/kg/d，每天1次至术后第5天，用来阻断自噬降解阶段；SNL假手术组（sS组）不结扎L5神经，其他手术步骤同SNL；SNL组（S组）建立SNL神经病理性疼痛模型；SNL空白组（S+V组）建立CCI模型后腹腔注射生理盐水15 mg/kg/d，每天1次至术后第5天；SNL氯喹组（S+C组）建立CCI模型后进行腹腔注射氯喹，15 mg/kg/d，每天1次至术后第5天，用来阻断自噬降解阶段。

2.方法

根据Bennet GJ的报道[7]进行CCI (Chronic Constriction Injury)手术操作。10%水合氯醛麻醉后，切开左侧大腿中部皮肤肌肉，暴露、分离坐骨神经，用4-0丝线进行三道宽松结扎，间距1～1.5 mm。冲洗，逐层缝合。置于单笼饲养7天。CCI假手术组组除了不进行神经结扎外，其他与CCI组操作相同。

SNL (Spinal Nerve Ligation)手术参照Kim方法[8]，按照手术标准操作，10%水合氯醛麻醉后，以L4水平为中心，暴露大鼠左侧腰椎3～4 cm，分离并且适当少量切除椎旁肌肉，咬去横突暴露L5神经，用4-0号丝线扎紧神经，结扎处远端剪断神经后，冲洗，逐层缝合。手术后继续喂养大鼠至术后第7天。SNL假手术组组除了不进行神经结扎外，其他与SNL组操作相同。所有手术操作，由同一人完成。

将被测大鼠单独置于带金属丝网眼板(孔径0.8×0.8 cin)的透明有机玻璃箱(50 cm×30 cm ×20 cm)中,安静的适应环境10～30 min。测定痛阈前,大鼠无寻觅、排便、排尿以及栖息在后腿上等动作。机械缩足反射阈值(MWT)采用von Frey测痛仪测定。用金属探头垂直刺激大鼠左、右后脚底。刺激强度逐渐增大，大约3 s内使大鼠后脚产生快速缩足、扬足或添足反应。首先测定从0. 6 g 开始，当此力度不能引起阳性反应，则给予相邻大一级的力度刺激，如出现阳性反应则给予相应小一级力度刺激，连续进行直至出现第1 次阳性和阴性反应的情况，此时的阳性反应力度为阳性反应最小力度，连续测量3次，间隔5 min，取其平均值。测定时间固定为上午8点到下午8点之间，术前3天、术后1天、3天、5天、7天进行行为学测试，行为学测试操作为同一人，并且不知晓分组情况，以减小偏倚。

CCI组大鼠7天后处死，取脊髓L4～6；SNL组大鼠7天后处死，取脊髓L4～5。加入预冷的蛋白裂解液50 µg/100 mg，冰上剪碎脊髓后，使用超声进一步打碎脊髓组织，冰上静置30 min后，将匀浆置于4℃下15 000转/min，离心20 min。取上清，采用BCA法进行蛋白定量，测定蛋白浓度。根据浓度曲线调整浓度后，加入loading buffer后进行99摄氏度，3分钟的蛋白变性。应用12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温注射1 h，加入一抗4度冷房过夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1.5 h，TBST洗3次，每次10 min，滴ECL发光液显影。应用GE发光机获取图片，应用ImageJ进行图像灰度值分析。以穆迪调带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

3.统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件。计量结果以均数±标准误(±SEM)表示，重复测量设计资料比较采用重复测量设计的方差分析，各组之间进行单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 各组大鼠行为学比较

各组大鼠术前行为学没有明显差异; sC组与C组相比较第3天出现明显行为学差异，说明CCI模型建立导致神经病理性疼痛；C+C组与C+V组比较，行为学指标第1天开始出现统计学差异的下降，说明应用氯喹抑制自噬导致神经病理性疼痛加强；sS组与S组相比，较术后第1天的行为学指标出现统计学差异，说明SNL模型导致严重的神经病理性疼痛；S+V组、S+C组中，行为学指标第1天开始出现统计学差异，说明应用氯喹抑制自噬导致SNL模型疼痛进一步加强；C组与C+V组没有统计学差异；同样的，S组与S+V组没有统计学差异（见图1）。

图1 A: sC, C, C+V, C+C组机械缩足反射阈值的比较*P ＜ 0.05, C组与sC组相比；#P ＜ 0.05, C+C组与C+V组相比, C+V组与C组比较无统计学差异B: sS, S, S+V, S+C组机械缩足反射阈值的比较*P ＜ 0.05, S组与sS组相比; #P ＜ 0.05, S+C组与S+V组相比, S+V组与S组比较无统计学差异Fig.1 A: Mechanical withdrawal threshold in sC, C, C+V, C+C groups*P ＜ 0.05, group C compared with group sC. #P ＜ 0.05, group C+ C compared with group C+V, there is no signi fi cant difference between C+C and C.B: Mechanical withdrawal threshold in sS, S, S+V, S+C groups*P ＜ 0.05, group S compared with group sS. #P ＜ 0.05, group S+C compared with group S+V, there is no signi fi cant difference between S+C and S.

2.各组大鼠脊髓自噬相关蛋白LC3，p62表达的比较

sC组与C组中，两组LC3、p62明显增加，说明通过组间比较CCI模型疼痛建立后自噬受损；C+C组与C+V组相比，LC3明显增加，说明CCI模型应用氯喹后自噬进一步受到抑制。S组与sS组相比，LC3-II、p62灰度值明显增加，说明SNL模型自噬受损；S+C组与S+V组LC3灰度值相比明显增加，说明氯喹加重自噬的抑制；C组与C+V组没有统计学差异，S组与S+V组没有统计学差异（见图2、3）。

讨 论

本研究结果通过测试两种神经病理性疼痛模型行为学表现从而证明手术后神经病理性疼痛模型的成功建立，并且检测两个自噬相关蛋白的表达。LC3（微管相关蛋白-3）是经典的自噬指标。自噬发生后自噬小体增多，LC3-II表达增多[9]。由于自噬是一个动态变化的过程，并不能根据自噬小体多少来评价自噬潮水平，自噬起始的增加以及自噬降解步骤的减少都可以增加自噬小体数量，所以检测p62，用来反映自噬降解步骤的情况。根据文献报道，自噬降解水平增强，p62减小[10]。通过对sC组与C组LC3-II以及p62的分析，以及上述两个指标得知自噬小体的数量增加和自噬降解水平降低，说明自噬功能受损，由于自噬是动态过程，从时间点观测，上述两个指标可能得出不严谨的结论，所以我们应用自噬的抑制剂氯喹，来阻断自噬小体降解水平，进一步判断神经病理性疼痛中自噬受损是否加重，疼痛表现是否也进一步加重。C+C组与C+V组两组进行比较，应用氯喹的模型组（C+C组）LC3-II水平增高，即自噬小体水平增加，证实了应用氯喹对自噬降解阶段的阻断，行为学分析上C+C组MWT从第1天开始明显下降。这说明，神经病理性疼痛模型CCI中，自噬受损会加重神经病理性疼痛。

图2 各组LC3表达情况(±SEM)xFig.2 The expression level of LC3 in each group (±SEM)

图3 sC，C，sS，S组p62表达情况(±SEMx )Fig.3 The level of p62 in group sC, C, sS, and S (±SEM)

S组与sS组相比，LC3-II、p62灰度值明显增加，从上述指标来看，在SNL神经病理性疼痛模型中自噬降解阶段受到抑制。并且进一步证实自噬受到抑制会加重SNL模型中神经病理性疼痛的表现，S+C组与S+V组相比，LC3-II表达升高，并且行为学上S+C组行为学分析从第1天开始明显下降。由此可见SNL模型中自噬受损可以导致神经病理性疼痛的加重。

自噬无疑是一个热门话题，并且在基础实验及临床应用上，通过调节自噬，可以为癌症、神经退行性疾病等病症提供可行性治疗方案。不同文献已经报道CCI、SNL模型中，应用自噬的激活剂，雷帕霉素（rapamycin）可以缓解神经病理性疼痛，并且抑制IL-1β释放[11,12]。本研究中通过对自噬的抑制从而加重神经病理性疼痛的佐证，我们可以得出这样一个结论，即神经病理性疼痛中，自噬是一种保护机制。这无疑为临床医生提供一个可以治疗神经病理性疼痛的新思路，也使得科研工作者对神经病理性疼痛有更进一步的认识。

虽然CCI有文章指出[13]，在C57b1/6实验鼠的CCI模型中，与自噬起始相关的蛋白Beclin1明显增加，并且应用实验鼠脊髓左右侧进行对比会得出不同模型中自噬改变不尽相同的结论，但是有趣的是应用组间对比都是7天取材的SD大鼠CCI、SNL模型中LC3，p62两个自噬指标趋势相同。虽然在不同疼痛模型中自噬水平改变可能不尽相同，但不可否认的是，通过激活自噬、增加自噬潮，可以缓解神经病理性疼痛[12]，并且神经病理性疼痛中自噬过程是受到阻断的，并且进一步阻断自噬会加重神经病理性疼痛。

本文首次分别对SNL和CCI两种疼痛模型应用氯喹阻断自噬降解。然而长期观察CCI模型中自噬特异性蛋白是否变化有待进一步研究，并且神经病理性疼痛中自噬与凋亡的关系以及其机制，以及自噬在不同神经细胞内以及细胞相互间的调控机制仍有待进一步阐明。

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[13]Laura Berliocchi, Maria Maiarù, Giuseppe Pasquale Varano,et al. Spinal autophagy is differently modulated in distinct mouse models of neuropathic pain. Molecular Pain, 2015, 2, 11:3.

AUTOPHAGY IN THE SPINAL CORD IS ALTERED IN SNL AND CCI NEUROPATHIC PAIN MODELS*

LIU Yong-Da1, HAN Guang2, WANG Zhi-Bin1, ZHAO Ping1,2△
(1Department of Pain, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China;2Department of Anesthesiology, shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China)

Objective: To investigate the role of autophagy in neuropathic pain. Autophagy-related proteins LC3 and p62 were analyzed in CCI and SNL models. Methods: SD rats (200-300 g) were randomly divided into eight groups (n=5): sham CCI group (sC), CCI group (C), CCI+Chloroquine group (C＋C),CCI+vehicle group (C+V), SNL group (S), sham SNL group (sS), SNL+Chloroquine group (S+C), SNL+vehicle group (S+V). As a neuropathic pain-related behavioral test, mechanical withdrawal threshold (MWT)were recorded before operation (baseline) and day 1, day 3, day 5, and day 7 post operation. The expression of LC3 and p62 were examined in group sC, group C, group sS, and group S. In groups C+C, C+V, S+C and S+V, the level of LC3 was tested. Results: CCI and SNL models induced a severe reduction of neuropathic pain-related MWT, and chloroquine administration enhanced neuropathic pain. Compared with group sC,LC3 and p62 protein levels were signi fi cantly changed in group C. Compared with group sS, the expression level of LC3 and p62 were significantly increased in group S. Besides, the expression level of LC3 was signi fi cantly higher in group C+C than that of group C+V. In group S+C, the LC3 level was also signi fi cantly increased compared with group S+V. Conclusion: Autophagy in the spinal cord was differently altered in SNL and CCI models. Chloroquine, an autophagy inhibitor, administration could enhance neuropathic pain.Increasing autophagy might be a potential treatment for neuropathic pain.

Neuropathic pain; Autophagy; LC3; p62; Chloroquine

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.07.003

国家自然科学基金资助课题（No.81600971）

△通讯作者 zhaop@sj-hospital.org