顺铂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬*

林琼燕, 生秀杰， 刘娟, 熊汉真, 王沂峰

510150广州，广州医科大学附属第三医院 妇产科(林琼燕、生秀杰、刘娟)， 病理科(熊汉真)； 510218广州,南方医科大学附属珠江医院 妇产科(王沂峰)

•应用基础研究•

顺铂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬*

林琼燕, 生秀杰， 刘娟, 熊汉真, 王沂峰△

510150广州，广州医科大学附属第三医院 妇产科(林琼燕、生秀杰、刘娟)， 病理科(熊汉真)； 510218广州,南方医科大学附属珠江医院 妇产科(王沂峰)

目的探讨顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬的影响,并初步探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在其中的作用。方法透射电镜观察自噬泡形成，免疫荧光检测微管相关蛋白1轻链3融合蛋白II(microtubule-associated protein 1 light chain 3 fusionprotein II，LC3II) 的荧光聚集情况。采用Westerblot检测mTOR通路中的PI3K、AKT及mTOR蛋白的表达。结果顺铂(20μg/mL)能诱导Ishikawa细胞发生自噬,其中24h组明显高于12h组(P<0.05)；与对照组(20μg/mL-0h组)相比较，自噬相关蛋白-LC3Ⅱ的表达随着时间延长表达增加(P<0.05)。磷酸化AKT1、磷酸化mTOR及PI3Kp85蛋白表达水平随着时间延长表达下降。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)与顺铂共培养组自噬小体及LC3Ⅱ蛋白表达少于顺铂组，但高于对照组。结论顺铂可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而诱导子宫内膜癌细胞发生自噬。

顺铂； 子宫内膜癌； 自噬； PI3K/AKT/mTOR信号通路

近年来，研究发现细胞自噬跟3大疾病密切关联：衰老、神经退行性疾病及肿瘤。细胞自噬是一种程序性死亡，受到20余种基因-自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)的调控。是一系列相关基因严格调控的复杂的生物学过程。随着社会结构及饮食习惯的改变,子宫内膜癌的发病率逐年增加[1]。顺铂为晚期及复发性子宫内膜癌的一线化疗药物，其是否影响子宫内膜癌细胞的自噬，及其机制仍亟待阐明。研究发现， PI3K/AKT/mTOR(磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B/雷帕霉素靶蛋白)信号通路在子宫内膜癌的发病发展过程中起着相当重要的作用[2]，可能作为子宫内膜癌治疗的新靶点。本研究旨在探讨化疗药物顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬的影响,以及PI3K/AKT/mTOR信号转导途径在其中所起的作用，为进一步完善顺铂在子宫内膜癌治疗作用中自噬机制理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及细胞培养 人子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa细胞由广州医科大学附属第三医院实验室保存。将其置入含10%新生小牛血清，含青霉素及链霉素的RPMI培养基，在37℃含CO2及饱和湿度的恒温培养箱内培养。

1.1.2 主要试剂 注射用顺铂(冻干型)购自齐鲁制药有限公司；胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)购自北京义翘神州生物技术有限公司；胎牛血清及RPMI-1640培养基购自Hyclone公司。鼠单克隆PI3K p85抗体,鼠单克隆AKT1,兔多克隆AKT1(phospho S473)抗体,兔克隆mTOR抗体,兔多克隆微管相关蛋白1轻链3融合蛋白Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3 fusionprotein II,LC3II)抗体购自Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 透射电镜检测自噬小体 将Ishikawa细胞用20μg/mL顺铂处理0、12、24小时，估计细胞数达到106时应用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 500转/分钟离心10分钟弃培养基,缓慢注入2%多聚甲醛和0.1%戊二醛，室温固定1小时，漂洗，再用1%锇酸冰上固定2小时，漂洗后用50%、70%、90%、100%乙醇依次脱水10分钟，100%丙酮固定10分钟3次，丙酮与环氧树脂3∶1包埋过夜，再放入纯包埋剂中6小时，65℃烤箱过夜后切成70nm厚度的超薄切片，醋酸铅铀染色，自噬体在透射电子显微镜(JEM-1010 ，Matsunaga Manufacturing, Japan)下观察并拍照。实验重复3次。

1.2.2 细胞免疫荧光检测LC3Ⅱ蛋白表达 20ug/mL顺铂处理Ishikawa细胞0h,12h,24h，细胞爬片用4%多聚甲醛室温下固定30分钟。按说明书操作，使用0.2% Triton X-100室温孵育5分钟。加入10%正常山羊血清封闭30分钟，加入LC3II一抗4℃孵育过夜，加入荧光标记二抗(1：200)室温湿盒避光孵育1小时，加入DAPI细胞染色液室温湿盒避光孵育5分钟，抗荧光淬灭剂封片。镜检，拍照。阳性细胞率的计算：波长353.6nm光线下观测200倍视野，细胞质呈现明显绿色荧光颗粒的细胞为阳性细胞，更换光源，改用自然光源，计算同一视野改用自然光线后的细胞总数。随机选择5个高倍镜视野，计数细胞。

1.2.3 Westerblot检测mTOR通路中的PI3K、AKT及mTOR蛋白 Ishikawa细胞接种6孔板，用20ug/mL顺铂处理Ishikawa细胞0h,12h,24h，每组 Ishikawa 细胞应用冰PBS缓冲液洗两次，并重悬于 RIPA裂解液中。样品于4°C 12 000 rpm离心20分钟,提取上清，应用BCA法测量蛋白浓度。 SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜，应用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1小时或4℃过夜，取出合适的一抗稀释浓度(浓度：PI3K p85抗体,1:1 000; 磷酸化AKT1抗体, 1:2 000; 总AKT1抗体,1:1 000; 磷酸化 mTOR 抗体, 1:2 000; 总mTOR抗体, 1:5 000; GAPDH, 1:5 000),37℃孵育2h再应用TBST洗膜5分钟，3次。将相应二抗稀释液加入后37℃孵育1h。应用TBST洗膜5分钟，3次。应用蒸馏水漂洗膜2分钟，弃去液体。共洗3次。GAPDH为内参。将杂交膜置于一透明塑料板上，使用1支干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5分钟。放至暗盒，显影。实验重复3次。

1.2.4 应用IGF-1与顺铂共培养Ishikawa细胞 为了进一步证明顺铂诱导Ishikawa细胞发生自噬是否通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用,应用PI3K激动剂：IGF-1与顺铂共培养Ishikawa细胞，实验分组如下：对照组、20ug/mL顺铂组及共培养组(20ug/mL顺铂+100ng/mL IGF-1)，细胞培养24h后进行透射电镜检测自噬小体及LC3Ⅱ蛋白细胞免疫荧光检测。

1.3 统计学处理

数据以平均数加减标准差(means±SD)或平均数加减标准误(means±SEM)表示，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析,通过方差分析和配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 顺铂对Ishikawa细胞自噬的影响

应用透射电镜观察20μg/mL顺铂处理12小时和24小时后的Ishihawa细胞中自噬体形成情况。20μg/mL-12h组，染色质固缩，细胞内出现双层膜组成的自噬体。20μg/mL-24h组，细胞出现核固缩，空泡明显。与对照组(20μg/mL-0h组)相比，20μg/mL-12h组的细胞内自噬体增加；20μg/ml-24h组较12h组的细胞内自噬体增加(图1A)；

应用免疫荧光共聚焦检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达，结果显示，20μg/mL-12h组LC3II表达高于对照组，20μg/mL-24h组较12h组的LC3II表达增加(图1B)。

图1 顺铂诱导Ishikawa细胞发生自噬

2.2 顺铂对mTOR信号通路的抑制作用

Western blot检测PI3K p85, 磷酸化AKT1,总AKT1, 磷酸化mTOR和总mTOR蛋白的表达。结果显示， 20μg/mL-12h组PI3K p85, 磷酸化AKT1及磷酸化 mTOR蛋白表达较对照组减少，20μg/mL-24h组与20μg/mL-12h组比较，上述蛋白表达量减少。 但总AKT1及总mTOR的表达量没有明显变化(图2)。

图2 Western blot检测PI3K p85, p-AKT1(磷酸化AKT1), p- mTOR(磷酸化mTOR), 总AKT1和总mTOR蛋白的表达

20μg/mL-12h组中PI3K p85, p-AKT1及p- mTOR蛋白表达量少于对照组，20μg/mL-24h组与20μg/mL-12h组比较，上述蛋白表达量减少。但总AKT1及总mTOR的表达量没有明显变化。**:P<0.05。

2.3 IGF-1与顺铂共培养逆转顺铂对子宫内膜癌细胞自噬的作用

为了进一步证明顺铂诱导ishikawa细胞发生自噬可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用，本实验设计了PI3K激动剂-IGF-1与顺铂共培养，实验分组如下：对照组、顺铂组(20ug/mL)及共培养组(20ug/mL顺铂+IGF-1 100ng/mL)，细胞培养24h后透射电镜检测自噬小体，免疫荧光检测LC3Ⅱ蛋白表达情况。结果显示，共培养组透射电镜检测自噬小体及LC3Ⅱ蛋白表达均少于顺铂组，但高于对照组(见图3)。

图3 IGF-1与顺铂共培养逆转顺铂诱导Ishikawa细胞发生自噬的作用

A:实验分组为顺铂组、共培养组及对照组。透射电镜显示，顺铂与IGF-1共培养减少了Ishikawa细胞内自噬小体的形成(箭头所示:自噬小体)；B:细胞免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达情况。注：merge:细胞核与细胞浆重叠融合后的图像。

3 讨 论

子宫内膜癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，是导致女性病人死亡的主要肿瘤之一[3]。近年来，自噬被认为既可能抑制肿瘤的生长，也可能在应激条件下或耐药情况下促进肿瘤生长[4-5]。自噬，又称II型程序性细胞死亡(type II programmed cell death)，是以胞质内出现双层膜结构包裹变性蛋白质和老化细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化 ”的一系列生化过程。是单细胞生物和动植物细胞中广泛存在着的降解、再循环系统的重要组成部分[2]。正常细胞通过适量的自噬来清除老化细胞内的细胞器、变性蛋白质及核酸等，当细胞在饥饿、生长因子缺乏、细胞内应激或者生长发育信号的刺激下，自噬大量增加。

在自噬体的检测方面，透射电镜被称为自噬检测的金标准[6]。它能定性检测细胞自噬发生的一系列超微结构(如隔离膜、自噬泡、自噬溶酶体),能有效地鉴别自噬、凋亡和坏死,通过透射电镜不仅可观察到自噬体典型的双层膜结构,还可量化细胞内自噬体占胞质总体积的大小,从而判断自噬的激活或抑制[7]。LC3是与自噬体可靠关联的蛋白标记物，它是哺乳动物细胞中Atg8基因的同源物,定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,参与自噬体的形成。可分为两种类型，即Ⅰ型和Ⅱ型。当自噬未发生时，细胞内合成的LC3经过加工，成为表达于胞浆内的可溶性LC3Ⅰ。但是，当自噬发生时，LC3Ⅰ被Atg7进一步活化，经泛素样加工修饰后与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3Ⅱ[8]。LC3Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少成正比[9-11],LC3Ⅱ是自噬体的标志分子[12-13]，自噬的活性与LC3Ⅱ的表达强度密切相关。本课题的前期研究结果提示顺铂对Ishikawa细胞具有抑制细胞增殖的作用，并呈时间依赖性，能诱导Ishihawa细胞自噬相关蛋白-LC3Ⅱ表达量增加[14]。本研究使用透射电镜检测观察到顺铂诱导子宫内膜腺癌系Ishikawa细胞发生自噬，并且细胞免疫荧光检测也观察到自噬相关蛋白-LC3Ⅱ的表达随着时间的延长，表达量增加。杨轩[15]等在膀胱癌的研究中指出，顺铂经过诱导膀胱癌细胞自噬促进细胞凋亡，并且提出LC3 II的表达量与自噬的程度呈正比例，与本研究结果一致。

mTOR信号通路是细胞分裂和合成代谢的调节中心，为细胞启动翻译信号及细胞由G0/G1期进入S期所必需，与蛋白合成、细胞周期的调控密切相关[16-17]。介导细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生理功能，同时也是调节细胞自噬的重要信号通路[18]。它是自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬发生[19-20]。启动阶段的靶点主要为mTOR相关靶点，包括TOR复合体1(TOR complex1,TORC1)和I型PI3K。TORC1：mTOR由2个独立的复合体TORC1和TORC2构成。细胞内生长因子的信号及能量水平和营养状态的信息会通过Ⅰ型PI3K和AKT/PKB通路传递给TORC1，并在达到适当的水平时导致TORC1活化，从而激活mTOR，使自噬受到抑制。故而，可通过调节TORC1的活性来影响mTOR的活性，进而调节细胞自噬的活性[21]。我们的实验证实，加入顺铂后，随着时间延长，具有活性作用的PI3K p85,磷酸化AKT1及磷酸化mTOR表达量减少。但总AKT1及总mTOR的表达量没有明显变化，说明顺铂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱导子宫内膜腺癌Ishikawa细胞发生自噬。

为了进一步证明顺铂诱导Ishikawa细胞发生自噬是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，我们加入了PI3K激动剂-IGF-1与单纯顺铂组作比较(由于第一次实验发现顺铂处理24小时组透射电镜中自噬小体及LC3Ⅱ蛋白明显高于12h组，因此只选用24小时作为时间点)，发现顺铂与IGF-1共培养后自噬小体及LC3Ⅱ蛋白表达减少，表明激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可能抑制诱导细胞发生自噬。

诱导肿瘤细胞发生自噬与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路相关,在其他类型的肿瘤中也得到证实。在非小细胞肺癌的研究中[22]，桔梗皂苷-D可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号传导通路进而诱发细胞自噬。关于宫颈癌的研究指出[23]，甘草查耳桐A同样通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱发细胞发生自噬，与本研究结果一致。作为细胞周期非特异性药物-顺铂，除了抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜结构作为抗肿瘤的作用机制之外，我们的研究进一步提示，顺铂可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而诱导细胞自噬并发挥着抗肿瘤的作用，可能为顺铂对于子宫内膜癌细胞的另一抗肿瘤作用机制。本研究未进行Western blot进一步检测LC3Ⅱ蛋白的变化，希望在后续的实验研究中完善，并进一步从PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂方面入手，进一步研究自噬的机制，并在动物模型上进行探讨，以对子宫内膜癌细胞中调控自噬的分子机制进行深入探讨。

综上所述，顺铂可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,诱导子宫内膜癌细胞发生自噬。IGF-1逆转顺铂诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞发生自噬的作用。自噬参与化疗药物顺铂的抗肿瘤作用，可能是顺铂抗肿瘤作用的另一机制。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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CisplatinInducesEndometrialCarcinomaIshikawaCellAutophagybyInhibitingPI3K/AKT/mTORSignalingPathway*

Lin Qiongyan1，Sheng Xiujie1，Liu Juan1, Xiong Hanzhen2，Wang Yifeng3△

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,Guangdong,China; 2.DepartmentofPathology,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,Guangdong,China; 3.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity, 510218Guangzhou,Guangdong,China)

Objective: To investigate the effect of cisplatin on autophagy of Ishikawa cells and the role of PI3K / AKT / mTOR signal transduction pathway in endometrial carcinoma.MethodsTEM(transmission electron microscope) was used to observe the formation of autophagic vacuoles, fluorescence microscope was used to observe the fluorescence aggregation of green fluorescent protein and microtubule-associated protein 1 light chain 3 fusionprotein Ⅱ (LC3 Ⅱ), so as to detect whether cisplatin could induce autophagy in Ishikawa endometrial cancer cells. Western blot was performed to detect expressions of PI3K, AKT and mTOR proteins in mTOR pathway.ResultsCisplatin induced the autophagy of Ishikawa cells. Compared with 20 μg/mL-12 h cisplatin group , more autophagosomes were obversed in the 20 μg/mL-24 h group(P<0.05) . LC3II levels gradually increased in 20 μg/mL-12 h group and 20 μg/mL-24 h group in a time-dependent manner comparing with that in the control group. The expression levels of phosphorylated AKT1, phosphorylated mTOR and PI3K p85 decreased significantly over time. The expressions of autophagosome and LC3Ⅱ protein in co-culture group treated with IGF-1 were lower than those in pure cisplatin group, but higher than those of the control group.ConclusionCisplatin could induce the autophagy in Ishikawa endometrial cancer cells and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway may be involved in this process.

Cisplatin； Endometrial cancer； Autophagy； PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

2016- 10- 09

2017- 07- 01

*广州市卫生局一般引导项目资助项目(编号：20151A010106)

△王沂峰,E-mail:wyf1988@163.com

R737.33；R730.231

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.05.003

Lin QY , Sheng XJ , Liu J, et al. Cisplatin induces endometrial carcinoma Ishikawa cell autophagy by inhibiting PI3K / AKT / mTOR signaling pathway[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(5):337-342.[林琼燕,生秀杰，刘娟,等.顺铂通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬[J].肿瘤预防与治疗，2017,30(5):337-342.]