免试剂离子色谱（RFIC）法测定卷烟主流烟气总粒相物中的烟碱

李力，李东亮，张威，胡清源，田永红

1 四川中烟工业有限责任公司技术研发中心，成都 610066；2 国家烟草质量监督检验中心，郑州 450001

免试剂离子色谱（RFIC）法测定卷烟主流烟气总粒相物中的烟碱

李力1，李东亮1，张威2，胡清源2，田永红1

1 四川中烟工业有限责任公司技术研发中心，成都 610066；2 国家烟草质量监督检验中心，郑州 450001

建立了一种免试剂离子色谱分离，外标法校正，紫外检测器检测的烟碱分析方法。方法采用一款弱酸功能基的聚合物基质阳离子交换柱Ionpac CS19，梯度淋洗，可在短时间内完成卷烟主流烟气总粒相物中烟碱的分离和定量检测。离子色谱分析时，烟草中除烟碱之外含量最高的两种生物碱（新烟草碱和去甲基烟碱）与烟碱的分离度较好，能够满足烟碱的定量测定要求。烟碱标准品峰面积的相对标准偏差为0.49%（n = 5），商品卷烟5个平行样的相对标准偏差为2.3%。方法的检出限为0.8 μg/支，线性范围1.00～500.0 μg/mL，线性相关系数0.9999，加标回收率在93.2%~101.7%之间。检测来自中国烟草标准化研究中心的两个标准卷烟，测定结果为0.588和0.942 mg/cig，标准值分别为0.60±0.085, 1.00±0.137 mg/cig，显示方法的准确度较好。研究结果为烟碱的测定提供了一种新的参考方法。

烟碱; 免试剂离子色谱法; 测定; 总粒相物

烟碱约占烟草生物碱总量的90%以上，是烟草中最重要的1种生物碱。烟草之所以用作各种形式的消费品，主要是因为烟草中的烟碱可作用于人的中枢神经系统，能使吸烟者感到兴奋和刺激。卷烟主流烟气中的烟碱均存在于烟气的粒相物中，因而准确测定卷烟主流烟气总粒相物中的烟碱，是卷烟质量控制的一项重要指标。

目前，卷烟烟气总粒相物中烟碱的测定主要采用气相色谱（GC）[1-3]或气相色谱－质谱联用法（GC-MS）[4-5]。采用这两种方法检测时，烟碱的提取一般采用异丙醇[1-2]，有时也使用二氯甲烷[3-4]、乙酸乙酯[5]等有机溶剂。由于仪器的信号响应受操作条件的影响较大，GC或GC-MS测定时一般采用内标法定量，茴香脑[2]、正十七碳烷[3]和喹哪啶[4]等是常用的内标试剂。采用GC-MS或使用毛细管柱进行分离的GC测定时，待测溶液在注入仪器分析前还需采用无水硫酸钠等试剂进行脱水处理[3-4]，操作比较麻烦。例如，中国测定卷烟主流烟气总粒相物中烟碱的国家标准(GB/T 23355-2009)[6]，采用的就是气相色谱法，以内标法进行定量，提取溶剂是异丙醇。在使用前，异丙醇必须采用干燥剂严格脱水。“GB/T 23355-2009”标准的另一个缺点是气相色谱分离时去甲基烟碱和新烟草碱（烟草中除烟碱之外含量最高的两种生物碱[7-9]）均和烟碱共流出，其测定的其实是这3种物质的混合物。

卷烟烟气总粒相物中的烟碱也可采用高效液相色谱（HPLC）[10-11]或超高效液相色谱（UPLC）法[12]测定。烟碱是一种二元弱碱，其pKb1= 6.13，pKb2=10.85。在水溶液中，当pH＞6.0时，烟碱才能以游离态存在；当pH＝7.8时，游离态烟碱约占烟碱总量的50%[13]。采用HPLC或UPLC测定时，如果流动相的pH较高，烟碱在流动相中能以游离态、单质子态和双质子态3种状态存在，洗脱时容易出现烟碱的色谱峰很宽和拖尾现象，因而谢笑天[10]和黄注传等人[11]的研究中，所采用的流动相pH值分别为3.0和1.95，不利于柱子的长期使用，降低柱寿命。刘正聪等人[12]则采用pH较高的碱性流动相进行洗脱，其流动相A为乙腈，流动相B为0.5%的乙酸钠溶液，梯度洗脱时A的含量从10%增加到12.5%，此时烟碱主要以游离态存在。这种方法虽然采用了柱效较高的1.7μm超高效液相色谱柱进行分离，但由于卷烟烟气中的成分复杂，种类众多，其萃取液在进行仪器分析前采用了固相萃相法（SPE）进行净化，操作复杂，耗时长，不利于长期高通量分析。

离子色谱（IC）是高效液相色谱法的一种，其分离是基于淋洗液与固定相上的离子交换基团之间发生的离子交换反应，对于易极化和疏水性较强的离子，分离机理还包括非离子交换的吸附过程。目前，IC不仅可以解决常规无机阴、阳离子的有效分析，对于氨基酸、有机胺和糖类等一些采用常规HPLC无法分析或难以分析的化合物的检测也具有优势[14-15]。现在，已有采用IC测定卷烟烟气中烟碱的报道[16-17]，由于烟碱在普通离子色谱柱上的保留时间非常长，很难被洗脱下来，这些学者分析时均在离子色谱的淋洗液中加入了有机溶剂，以减少烟碱的吸附。免试剂离子色谱（RFIC）是IC的一种新运行方式，其分析时的酸、碱淋洗液无需人工配制，而是采用电解方式，通过精确地控制施加电流在线产生[18]。采用RFIC分析时[19]，由于无需使用酸碱试剂配制淋洗液，消除了人工配制溶液时的操作误差和由于试剂不纯所产生的影响，分析人员只用水和鼠标就能精确而在线地产生无污染（例如阴离子分析时的二氧化碳污染）的洗脱液，在简化操作的同时提高了分析的准确度和重现性。RFIC分析的另一个优点[18-19]是适合进行梯度洗脱，由于淋洗液的发生通过电流控制，生成方便，而且产生后直接进入分离柱，不通过色谱泵，所经过的管路短，从而减少了延迟体积和两次进样之间的平衡时间，在提升仪器性能的同时缩短了分析时间，因而近年来很受检测人员欢迎[14,20-22]。目前，采用RFIC测定烟草或卷烟烟气中烟碱的研究尚未见报道。本文采用一款弱酸功能基的聚合物基质阳离子交换柱，以RFIC测定了卷烟主流烟气总粒相物中的烟碱，测定时新烟草碱和去甲基烟碱与烟碱的分离度均较好，能够满足烟碱的定量测定要求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

2014年份市售的商品卷烟。

烟碱、新烟草碱和去甲基烟碱标准品均购置于 Toronto Research Chemicals（Toronto, Ontario;Canada）；正十七碳烷（色谱纯，美国Acros Organics公司）；异丙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；硫酸（98%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；高纯氦气（含量不低于99.999% (v/v)，四川梅塞尔气体产品有限公司）；中国烟草标准化研究中心2013年度卷烟烟气分析用1#和2#标准卷烟。

RM 200A转盘吸烟机（德国Borgwaldt KC公司）；7890A气相色谱仪（美国Agilent公司），配有火焰离子化检测器，Agilent J & W 气相色谱柱（H-50+, 30 m × 0.530 mm ， 1.00 µm）；SM 450 直线吸烟机（英国Cerulean公司）；Dionex ICS 3000 RFIC™离子色谱仪（美国戴安公司），配有电导和紫外检测器，CERS 500（4 mm）抑制器，CS12A（4× 250 mm）、CS16（5 × 250 mm）和CS19（4 ×250 mm）交换柱，CS12A（4 × 50 mm）和CG16（5 × 50 mm）保护柱；Direct-Q型超纯水器（美国Millipore公司）；8510E-DTH型超声波清洗器（美国Branson Ultrasonics公司）。

1.2 标准溶液配制

准确称取0.5 g 烟碱标准品，用0.025 mol/L H2SO4溶解后定容到50 mL，制得浓度为10 mg/mL的标准储备溶液（4 ℃保存）；将标准储备溶液用0.025 mol/L H2SO4稀释成烟碱浓度分别为1.00, 2.00,5.00, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0, 200.0和 500.0 μg/mL 的系列标准工作溶液。

1.3 样品制备

实验前，将市售的商品卷烟按照一定的烟支重量和吸阻要求进行分选，然后在（22±2）℃、相对湿度（60±5）%条件下平衡48 h。采用直线式吸烟机，按照ISO 3308: 2000[23]中规定的要求进行抽吸，每个样品同一孔道抽吸5支卷烟。卷烟抽吸完成后，将捕集有粒相成分的滤片及擦拭捕集器的¼滤片一起放入250 mL萃取瓶中，加入100 mL 0.025 mol/L H2SO4，然后放入超声波清洗器中萃取30 min，用孔径为0.45 μm的水系滤膜过滤后进行IC分析。

1.4 色谱条件

采用CS19交换柱（4 mm × 250 mm）进行分离，柱温为30 ℃；检测池的池温为35 ℃；淋洗液为甲烷磺酸溶液（由免试剂离子色谱的Dionex EGC Ⅲ MSA Eluent Generator Cartridge自动生成），流速为1.0 mL/min，梯度洗脱，甲烷磺酸的起始浓度为0.040 mol/L，15分钟后增加到0.060 mol/L，然后迅速降低为0.040 mol/L（0.1 min），平衡5 min后进行下次分析；紫外检测，检测波长为260 nm；进样体积为10 μL；根据保留时间定性，外标法峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂和检测波长的选取

烟碱的提取可采用有机溶剂[1-5,10]、碱性溶液[7,12,24]和酸性溶液[4,11,25-27]等。采用有机溶剂提取时，卷烟烟气中的一些疏水性成分也会被提取出来。这些成分在IC分析时的保留时间很长，有时甚至无法从色谱柱上被洗脱下来，污染色谱柱，使其应用受到限制。采用碱性溶液提取时，烟碱主要以游离态存在，不太稳定，原因主要是游离态的烟碱可随水蒸气挥发，而且从分子结构看，烟碱分子不稳定，在中性和偏碱性条件下可发生多种变化，因而碱性提取液的保存时间短，样品处理后必须尽快分析，重复性不好[28]。在烟碱的水溶液中加入硫酸等无机酸可与烟碱生成盐，增大其溶解度，也改变了游离态烟碱易与水蒸汽共挥发的性质，因而烟碱在酸性溶液中更稳定[29]。研究显示采用0.025 mol/L H2SO4提取的卷烟烟气总粒相物溶液，放置1个月后烟碱的含量基本没有变化[11]，而且此时烟碱以稳定的质子态存在[13]，对后续的IC分离有利，因而采用0.025 mol/L H2SO4提取烟碱。

在IC分析时烟碱的电导响应很弱，但是烟碱[29-30]的吡啶环在260 nm处有较强的紫外吸收，其水溶液的吸光系数为18.6，加入盐酸或硫酸酸化后吸光系数增大，在H+浓度达到0.02 mol/L后，烟碱的吸光系数达到稳定，为34.3，因而采用紫外检测器进行检测。配置浓度为50 μg/mL的烟碱标准溶液（溶剂为0.025 mol/L H2SO4）进行IC分析，采用紫外检测器在200 ~ 800 nm范围内进行扫描（图1）。结果发现烟碱的最大吸收波长为260.43 nm，与水溶液时的260 nm非常接近，因而选择260 nm作为检测波长。

图1 烟碱的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of nicotine

2.2 色谱条件的选择

在传统的高效液相色谱法中，选择性的改变主要通过流动相来实现，固定相的发展主要是提高柱效和消除一些非理想行为[31]。例如，采用小颗粒的色谱柱填料提高柱效，采用内嵌极性基团的键合相固定相降低硅胶表面的硅醇基活性以减少碱性化合物的拖尾等[31-32]。在IC分析中固定相的选择是关键。在抑制型IC分析中，选择性的改变主要是通过选用不同的固定相来实现，固定相的性质首先决定了分离的机理，并依次决定流动相的组成与检测方式的选择[31]。长期以来，烟碱的测定无法采用离子色谱法，原因主要是离子色谱柱填料的树脂骨架主要是苯乙烯-二乙烯 基 苯（Phenylethylene-Divinylbenzene; PE-DVB）或乙基乙烯基苯-二乙烯基苯（Ethylvinylbenzene-Divinylbenzene; EVB-DVB）的共聚物，这种材料对烟碱的吸附能力非常强，导致其在色谱柱上的保留时间很长，以致无法检测。采用CS12A阳离子交换色谱柱，在甲烷磺酸浓度为0.060 mol/L时等度洗脱，测定了浓度为20 μg/mL的烟碱标准溶液。结果显示，烟碱的保留时间为20.10 min，色谱峰很宽（峰宽4.40 min），而且拖尾严重（图2）。而对于CS16柱，在甲烷磺酸浓度为0.070 mol/L时等度淋洗60 min，烟碱仍未出峰，根本无法检测。

图2 采用CS12A柱分离时烟碱色谱图Fig.2 Chromatogram of nicotine with CS12A column

IonPac CS19柱是2012年推出的一款羧酸功能基聚合物基质阳离子交换柱，采用了当时最新的接枝技术（Grafting Technology）。这种阳离子交换柱的柱效高，可进行梯度淋洗，对小分子的极性胺（如甲胺、乙胺）和生物胺[14]的选择性好，因而被作为首选的色谱柱进行实验。实验发现在甲烷磺酸浓度0.040、0.050和0.060 mol/L时等度洗脱，烟碱的分离较好，如果采用梯度洗脱（甲烷磺酸的起始浓度为0.040 mol/L，15分钟后增加到0.060 mol/L）则烟碱的色谱峰对称性和分离度更好，其分离度大于1.2，因而采用梯度淋洗的方式分离。图3和图4分别是采用实验方法分析时烟碱标准品和卷烟样品的离子色谱图。

图3 烟碱标准品的离子色谱图Fig.3 IC chromatogram of nicotine standard

图4 卷烟样品的离子色谱图Fig.4 IC chromatogram of cigarette sample

2.3 其他烟草生物碱的影响

烟草中的生物碱除烟碱外还有去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明和假木贼碱等。这些生物碱的含量同烟碱相比均很低，去甲基烟碱的含量约为烟碱的4.2%，新烟草碱的含量约为烟碱的1.5%，而麦斯明和假木贼碱的含量更低，一般不足新烟草碱含量的1/5[7-9]。配置了一种含有烟碱（40 μg/mL）、去甲基烟碱（2 μg/mL）和新烟草碱（2 μg/mL）的标准溶液，采用实验方法进行分析，结果发现去甲基烟碱和新烟草碱的分离度为1.30，新烟草碱与烟碱的分离度为1.23（图5）。为了考察样品溶液中的去甲基烟碱和新烟草碱对烟碱的测定是否有影响，选取离子色谱图中烟碱色谱峰前有杂质峰的卷烟样品进行实验。根据保留时间定性，确认烟碱色谱峰前的杂质峰是新烟草碱，新烟草碱前面的物质是去甲基烟碱（图6）。向此溶液中加一定量含有去甲基烟碱和烟碱标准品的标准溶液（加入的烟碱浓度为40 μg/mL，去甲基烟碱浓度约为0.6 μg/mL），然后采用离子色谱分析（图7）。从图5 ~ 图7可以看出，去甲基烟碱对烟碱的测定没有影响，新烟草碱与烟碱的分离也较好（分离度大于1.2），能够满足烟碱的定量测定要求。为了考察气相色谱法分析时这两种烟草生物碱对烟碱测定的影响，配置了1个烟碱标准溶液，1个去甲基烟碱-新烟草碱混合标准溶液和1个含有烟碱、去甲基烟碱和新烟草碱的混合标准溶液，并与实际样品一起采用“GB/T 23355-2009”标准方法进行分析（图8-图11）。从图8-图11可以看出，烟碱的保留时间为3.825 min，去甲基烟碱和新烟草碱的保留时间为3.827 min，这3种化合物采用标准方法测定时共流出。

图5 烟碱、去甲基烟碱和新烟草碱的离子色谱图Fig.5 IC chromatogram of nicotine, nornicotine and anatabine

图6 卷烟烟气的离子色谱图Fig.6 IC chromatogram of cigarette smoke

图7 加标后卷烟样品溶液的离子色谱图Fig.7 IC chromatogram of spiked cigarette sample solution

图8 烟碱标准品的气相色谱图Fig.8 GC chromatogram of nicotine standard

图9 去甲基烟碱和新烟草碱的气相色谱图Fig.9 GC chromatogram of nornicotine and anatabine

图10 烟碱、去甲基烟碱和新烟草碱的气相色谱图Fig.10 GC chromatogram of nicotine, nornicotine and anatabine

图11 卷烟烟气的气相色谱图Fig.11 GC chromatogram of cigarette smoke

2.4 线性关系、检出限和重现性

采用实验方法分别对烟碱系列标准工作溶液进行测定，以色谱峰面积（y）对其浓度（x）进行线性回归（图12）。烟碱浓度在1.00 ～ 500.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y =0.3288x – 0.1829，线性相关系数R = 0.9999。将烟碱标准品配制成相应浓度，当信噪比（S/N）为3时，得到烟碱的仪器检出限为0.04 μg/mL，经换算后样品检出限为0.8 μg/支，完全能够满足卷烟的测定要求。配置50.0 μg/mL烟碱标准溶液，采用1.4节中色谱条件进行分析，连续进样5次，其色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.49%。取商品卷烟按照实验的方法进行检测，其5个平行样的RSD为2.3%，显示实验方法的精密度满足分析要求。

图12 烟碱标准线性曲线Fig.12 Regression curve for nicotine standard

2.5 准确度与加标回收率

方法的准确度通过测定样品的加标回收率（表1）和中国烟草标准化研究中心提供的两个标准卷烟（表2）来进行验证，回收率实验时的本底测定，低、中、高3个浓度的加标实验和两个标准卷烟的检测均测定的是5个平行样。低、中、高3个浓度的加标回收率分别为93.2%、101.7%和95.5%。两个标准卷烟的标准值分别为0.60±0.085 mg/支（mg/cig）和1.00±0.137 mg/cig，实验方法的测量值分别为0.59 mg/cig和0.94 mg/cig，显示方法的准确度很好。

表1 烟碱的加标回收率Tab.1 Recovery results of cigarette samples

表2 标准卷烟的检测结果Tab.2 Detection results for certi fi ed reference cigarettes (CRCs)

3 结论

由于传统的离子色谱柱树脂填料对烟碱的吸附能力非常强，导致其在IC分析时保留时间很长，很难采用简便的RFIC方法进行检测。本实验采用新型疏水性较弱的聚合物基质阳离子交换柱，在甲烷磺酸浓度较高时梯度洗脱，较好分离了烟碱、新烟草碱和去甲基烟碱，为烟碱测定提供一种新的参考方法，而且所建分析方法线性范围宽，操作简单，分析速度快，具有较好的重现性和准确度。

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：LI Li, LI Dongliang, ZHANG Wei, et al. Determination of nicotine in total particulate matter of mainstream cigarette smoke by reagent-free ion chromatography [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：huqy@ztri.com.cn

Determination of nicotine in total particulate matter of mainstream cigarette smoke by reagentfree ion chromatography

LI Li1, LI Dongliang1, ZHANG Wei2, HU Qingyuan2*, TIAN Yonghong1
1 Research & Development Center, China Tobacco Sichuan Industrial Co., Ltd., Chengdu 610066, China;2 China National Tobacco Quality Supervision & Test Center, Zhengzhou 450001, China

A method was developed for separation and determination of nicotine by reagent free ion chromatography (RFIC) coupled to ultraviolet detection with external calibration. Separation was achieved by gradient elution with a carboxylate-functionalized cationexchange column CS19 in a short time. Under the optimum elution conditions, no interferences existed between nicotine and anatabine (or nornicotine). The relative standard deviations for nicotine standard solution and cigarette sample were 0.49% and 2.3% (n=5), respectively.The linear range of nicotine was 1.00 ～ 500.0 μg/mL, with correlation coefficient (R) of 0.9999. The limit of detection (LOD) in terms of signal-to-noise of 3:1 is 0.8 µg/cig. The spiked recovery ranged from 93.2% to 101.7%. Two certi fi ed reference cigarettes (CRCs) from China Tobacco Standardization Research Center were determined. The determined results and certi fi ed values were 0.588, 0.942 mg/cig and 0.60±0.085, 1.00±0.137 mg/cig, respectively, indicating good accuracy of the method. The present method was proved a potential alternative to gas chromatography (GC), high performance liquid chromatography (HPLC), and ultra performance liquid chromatography(UPLC) method.

nicotine; reagent free ion chromatography; determination; total particulate matter

李力，李东亮，张威,等. 免试剂离子色谱（RFIC）法测定卷烟主流烟气总粒相物中的烟碱[J]. 中国烟草学报，2017,23（1）

中国烟草总公司减害技术重大专项项目“降低烟气中氨含量的材料筛选、合成及应用”[110201101027(JH-02)]

李 力（1973—），硕士，高级工程师，主要从事烟草化学分析方面的研究，Tel：028-86005064，Email：puyang20100729@163.com

胡清源（1965—）， Tel：0371-67672601，Email：huqy@ztri.com.cn

2016-02-29；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2016-09-26